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井上 浩一イノウエ コウイチ

所属部署医学研究科統合解剖学分野
職名准教授
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生年月日
Last Updated :2019/07/06

研究者基本情報

基本情報

    プロフィール:神経、血管系とそれらがかかわる病態に興味を持って研究しています。

研究活動情報

研究分野

  • 神経科学, 神経科学一般
  • 内科系臨床医学, 精神神経科学
  • 外科系臨床医学, 消化器外科学
  • 外科系臨床医学, 麻酔・蘇生学

研究キーワード

    発達, cell sorting, 脳, マイクロアレイ, 移動, 神経, GABA, 細胞移動, クロライドトランスポーター, カハールレチウス細胞, 国際情報交換, ドイツ, タウリン, 皮質板細胞, グリシン, てんかん, イメージング, 皮質形成異常, クロライドイオン, 大脳皮質, Cl^-ホメオスタシス, Chrolide, プリン受容体, 小脳, 肝細胞癌, 生物進化, 電気穿孔法, 言語, クロラドトランスポーター, 化学発癌

論文

  • TRPM7 channels play a role in high glucose–induced endoplasmic reticulum stress and neuronal cell apoptosis, Huang Y, Leng TD, Inoue K, Tao Y, Liu M, Horgen FD, Fleig A, Li J, Xiong ZG, J Biol Chem, 93, (37) 14393 - 406,   2018年09月, 査読有り
  • Potential implication of SGK1-dependent activity change in BV-2 microglial cells., Asai H, Inoue K, Sakuma E, Shinohara Y, Ueki T, International journal of physiology, pathophysiology and pharmacology, 10, (2) 115 - 123,   2018年, 査読有り
  • Effect of Redox-Modifying Agents on the Activity of Channelrhodopsin-2., Wu BM, Leng TD, Inoue K, Li J, Xiong ZG, CNS neuroscience & therapeutics, 23, (3) 216 - 221,   2017年03月, 査読有り
  • ASIC1 promotes differentiation of neuroblastoma by negatively regulating Notch signaling pathway., Liu M, Inoue K, Leng T, Zhou A, Guo S, Xiong ZG, Oncotarget, 8, (5) 8283 - 8293,   2017年01月, 査読有り
  • Possible divergence of serum- and glucocorticoid-inducible kinase function in ischemic brain injury., Inoue K, Neural regeneration research, 11, (9) 1396 - 1397,   2016年09月, 査読有り
  • Serum- and glucocorticoid-inducible kinases in microglia., Inoue K, Sakuma E, Morimoto H, Asai H, Koide Y, Leng T, Wada I, Xiong ZG, Ueki T, Biochemical and biophysical research communications, 478, (1) 53 - 59,   2016年09月, 査読有り
  • Role of serum- and glucocorticoid-inducible kinases in stroke., Inoue K, Leng T, Yang T, Zeng Z, Ueki T, Xiong ZG, Journal of neurochemistry, 138, (2) 354 - 361,   2016年07月, 査読有り
  • Acid Sensing Ion Channels (ASICs) in NS20Y cells - potential role in neuronal differentiation., O'Bryant Z, Leng T, Liu M, Inoue K, Vann KT, Xiong ZG, Molecular brain, 9, (1) ,   2016年06月, 査読有り
  • TRPM7 regulates vascular endothelial cell adhesion and tube formation., Zeng Z, Inoue K, Sun H, Leng T, Feng X, Zhu L, Xiong ZG, American journal of physiology. Cell physiology, 308, (4) C308 - 18,   2015年02月, 査読有り
  • Local anesthetic lidocaine inhibits TRPM7 current and TRPM7-mediated zinc toxicity., Leng TD, Lin J, Sun HW, Zeng Z, O'Bryant Z, Inoue K, Xiong ZG, CNS neuroscience & therapeutics, 21, (1) 32 - 39,   2015年01月, 査読有り
  • Zinc-permeable ion channels: effects on intracellular zinc dynamics and potential physiological/pathophysiological significance., Inoue K, O'Bryant Z, Xiong ZG, Current medicinal chemistry, 22, (10) 1248 - 1257,   2015年, 査読有り
  • Silencing TRPM7 in mouse cortical astrocytes impairs cell proliferation and migration via ERK and JNK signaling pathways., Zeng Z, Leng T, Feng X, Sun H, Inoue K, Zhu L, Xiong ZG, PloS one, 10, (3) ,   2015年, 査読有り
  • TRPM7 channels regulate glioma stem cell through STAT3 and Notch signaling pathways., Liu M, Inoue K, Leng T, Guo S, Xiong ZG, Cellular signalling, 26, (12) 2773 - 2781,   2014年12月, 査読有り
  • Acid-sensing ion channels in mouse olfactory bulb M/T neurons., Li MH, Liu SQ, Inoue K, Lan J, Simon RP, Xiong ZG, The Journal of general physiology, 143, (6) 719 - 731,   2014年06月, 査読有り
  • Pre- and post-synaptic switches of GABA actions associated with Cl- homeostatic changes are induced in the spinal nucleus of the trigeminal nerve in a rat model of trigeminal neuropathic pain, Neuroscience, 228, 334 - 8,   2013年, 査読有り
  • Role of TRPM7 channels in hyperglycemia-mediated injury of vascular endothelial cells., Sun H, Leng T, Zeng Z, Gao X, Inoue K, Xiong ZG, PloS one, 8, (11) ,   2013年, 査読有り
  • Decreased tonic inhibition in cerebellar granule cells causes motor dysfunction in a mouse model of Angelman syndrome., Egawa K, Kitagawa K, Inoue K, Takayama M, Takayama C, Saitoh S, Kishino T, Kitagawa M, Fukuda A, Science translational medicine, 4, (163) ,   2012年12月, 査読有り
  • Taurine inhibits the K+-Cl- cotransporter KCC2 to regulate embryonic Cl- homeostasis via the with-no-lysine (WNK) protein kinase signaling pathway., Inoue K, Furukawa T, Kumada T, Yamada J, Wang T, Inoue R, Fukuda A, The Journal of biological chemistry, 287, (25) 20839 - 20850,   2012年04月, 査読有り
  • Calcium-permeable ion channels involved in glutamate receptor-independent ischemic brain injury., Li MH, Inoue K, Si HF, Xiong ZG, Acta pharmacologica Sinica, 32, (6) 734 - 740,   2011年06月, 査読有り
  • Pathophysiologically relevant levels of hydrogen peroxide induce glutamate-independent neurodegeneration that involves activation of transient receptor potential melastatin 7 channels., Coombes E, Jiang J, Chu XP, Inoue K, Seeds J, Branigan D, Simon RP, Xiong ZG, Antioxidants & redox signaling, 14, (10) 1815 - 1827,   2011年05月, 査読有り
  • Cysteine 149 in the extracellular finger domain of ASIC1b subunit is critical for zinc-mediated inhibition., 18. Jiang G, Inoue K, Wu X, Papasian CJ, Wang J-Q, Xiong Z-G, Neuroscience , 93, 89 - 99,   2011年, 査読有り
  • The physiological roles of vesicular GABA transporter during embryonic development: a study using knockout mice., Saito K, Kakizaki T, Hayashi R, Nishimaru H, Furukawa T, Nakazato Y, Takamori S, Ebihara S, Uematsu M, Mishina M, Miyazaki J, Yokoyama M, Konishi S, Inoue K, Fukuda A, Fukumoto M, Nakamura K, Obata K, Yanagawa Y, Molecular brain, 3,   2010年12月, 査読有り
  • Developmental change in the electrophysiological and pharmacological properties of acid-sensing ion channels in CNS neurons., Li M, Kratzer E, Inoue K, Simon RP, Xiong ZG, The Journal of physiology, 588, (Pt 20) 3883 - 3900,   2010年10月, 査読有り
  • Low-concentration tributyltin perturbs inhibitory synaptogenesis and induces neuronal death in immature but not mature neurons., Yamada J, Inoue K, Furukawa T, Fukuda A, Toxicology letters, 198, (2) 282 - 288,   2010年10月, 査読有り
  • Acid-sensing ion channels in acidosis-induced injury of human brain neurons., Li M, Inoue K, Branigan D, Kratzer E, Hansen JC, Chen JW, Simon RP, Xiong ZG, Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 30, (6) 1247 - 1260,   2010年06月, 査読有り
  • Zinc-induced neurotoxicity mediated by transient receptor potential melastatin 7 channels., Inoue K, Branigan D, Xiong ZG, The Journal of biological chemistry, 285, (10) 7430 - 7439,   2010年03月, 査読有り
  • Silencing TRPM7 promotes growth/proliferation and nitric oxide production of vascular endothelial cells via the ERK pathway., Inoue K, Xiong ZG, Cardiovascular research, 83, 547 - 557,   2009年08月, 査読有り
  • In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning., Pignataro G, Meller R, Inoue K, Ordonez AN, Ashley MD, Xiong Z, Gala R, Simon RP, Journal of cerebral blood flow and metabolism : official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 28, (2) 232 - 241,   2008年02月, 査読有り
  • Transient receptor potential melastatin 7-like current in human head and neck carcinoma cells: role in cell proliferation., Jiang J, Li MH, Inoue K, Chu XP, Seeds J, Xiong ZG, Cancer research, 67, 10929 - 10938,   2007年11月, 査読有り
  • Brain-type creatine kinase activates neuron-specific K+-Cl- co-transporter KCC2., Inoue K, Yamada J, Ueno S, Fukuda A, Journal of neurochemistry, 96, (2) 598 - 608,   2006年01月, 査読有り
  • Characterization of newly cloned variant of rat glycine receptor alpha1 subunit., Inoue K, Ueno S, Yamada J, Fukuda A, Biochemical and biophysical research communications, 327, (1) 300 - 305,   2005年02月, 査読有り
  • Malfunction of respiratory-related neuronal activity in Na+, K+-ATPase alpha2 subunit-deficient mice is attributable to abnormal Cl- homeostasis in brainstem neurons., Ikeda K, Onimaru H, Yamada J, Inoue K, Ueno S, Onaka T, Toyoda H, Arata A, Ishikawa TO, Taketo MM, Fukuda A, Kawakami K, The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, 24, (47) 10693 - 10701,   2004年11月, 査読有り
  • Interaction of neuron-specific K+-Cl- cotransporter, KCC2, with brain-type creatine kinase., Inoue K, Ueno S, Fukuda A, FEBS letters, 564, (1/2) 131 - 135,   2004年04月, 査読有り
  • TNFalpha-induced ATF3 expression is bidirectionally regulated by the JNK and ERK pathways in vascular endothelial cells., Inoue K, Zama T, Kamimoto T, Aoki R, Ikeda Y, Kimura H, Hagiwara M, Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms, 9, (1) 59 - 70,   2004年01月, 査読有り
  • Identification of methylated proteins by protein arginine N-methyltransferase 1, PRMT1, with a new expression cloning strategy., Wada K, Inoue K, Hagiwara M, Biochimica et biophysica acta, 1591, (1-3) 1 - 10,   2002年08月, 査読有り
  • A novel dual specificity phosphatase SKRP1 interacts with the MAPK kinase MKK7 and inactivates the JNK MAPK pathway. Implication for the precise regulation of the particular MAPK pathway., Zama T, Aoki R, Kamimoto T, Inoue K, Ikeda Y, Hagiwara M, The Journal of biological chemistry, 277, (26) 23909 - 23918,   2002年06月, 査読有り
  • Scaffold role of a mitogen-activated protein kinase phosphatase, SKRP1, for the JNK signaling pathway., Zama T, Aoki R, Kamimoto T, Inoue K, Ikeda Y, Hagiwara M, The Journal of biological chemistry, 277, (26) 23919 - 23926,   2002年06月, 査読有り
  • IL-10 modulates antigen presentation by dendritic cells through regulation of NLRP3 inflammasome assembly during Chlamydia infection, 8. Omosun Y, McKeithen D, Ryans K, Kibakaya C, Blas-machado U, Li D, Singh R, Inoue K, Xiong Z-G, Eko F, Black C, Igietseme J, He Q, Infect. Immun., 83, 4662 - 4672,   2015年, 査読有り

MISC

  • Novel RING finger proteins, Air1p and Air2p, interact with Hmt1p and inhibit the arginine methylation of Npl3p, K. Inoue, T. Mizuno, K. Wada, M. Hagiwara, Journal of Biological Chemistry, 275,   2000年10月20日, Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) are involved in the mRNA processing and export and are post-translationally modified by methylation at arginine residues in their arginine-glycine-rich (RGG) domains. We screened the factors that can interact with the RGG domain of Np13p only in the presence of Hmt1p with the two-hybrid system in Saccharomyces cerevisiae. An isolated clone, YIL079, encodes a novel RING finger protein that was not directly bound to Npl3p but associated with the N terminus of Hmt1p. Thus, we designated the gene product Air1p (arginine methyltransferase-interacting RING finger protein). Air1p inhibited the Hmt1p-mediated methylation of Npl3p in vitro. Overexpression of Air1p repressed the Hmt1p-dependent growth of cells. Since homology searches indicate that the YDL175 gene product has significant identity (45%) with Air1p, we designated the gene AIR2. Air2p also has a RING finger domain and was bound to Hmt1p. Although single disruption of either gene gave no effect on the cell growth, cells lacking Air1p and Air2p grew at an extremely slow rate with accumulated poly(A)+RNA in the nucleus. Thus, Air1p and Air2p may affect mRNA transport by regulating the arginine methylation state of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins.

競争的資金

  • カハール・レチウス細胞等のGABAの積極的興奮性とその生理的意義の解明, 文部科学省, 科学研究費補助金(新学術領域研究(研究領域提案型)),   2011年 - 2012年, 井上浩一
  • タウリンによるKCC2活性制御の分子基盤とその意義の解明, 文部科学省, 科学研究費補助金(基盤研究(C)),   2011年 - 2011年, 井上浩一
  • グリオーマの移動・浸潤時に起こる細胞内イオン変化の可視化とその応用性の検討, 文部科学省, 科学研究費補助金(基盤研究(C)),   2008年 - 2010年, 熊田竜郎, 細胞内イオンイメージング法を用いて、グリオーマ細胞の移動時における自発的な細胞内Ca^<2+>とCl^-濃度の変化を可視化してその役割を検討した。グリオーマ細胞では細胞内Ca^<2+>濃度の頻度の変化は著しい加速を示す移動細胞の指標と成ったが、移動速度との関連性は無かった。細胞内Cl^-イオン濃度をFRET型インディケーターで測定し、細胞内におけるCl^-の局在性について検討した。また、細胞内Cl^-イオン濃度を変化させるとグリオーマ細胞の移動速度を変化させることが分かった。
  • 発達期大脳皮質神経細胞の垂直移動・分化関連遺伝子の網羅的同定及び解析, 文部科学省, 科学研究費補助金(基盤研究(C)),   2005年 - 2006年, 井上浩一, 古川智範, 子宮内電気穿孔法を用いて胎生13日齢のICRマウス胎仔脳室周囲の神経前駆細胞にEGFPを導入した。それらの細胞は徐々に脳表に移動(radial migration)していくが、遺伝子導入3日後ではEGFP陽性細胞は脳室帯、中間帯、辺縁帯にほぼ均等に分散している。そこで、胎生15日の脳室帯、胎生16日の中間帯、胎生18日の辺縁帯を脳スライスから切り出し、細胞を分離させた後、cell sortingによりEGFP陽性細胞のみを回収した。細胞数が不十分であったため、in vitro転写法により、2段階でRNAを増幅し後マイクロアレイを行った。細胞の垂直方向への移動と関係が示唆される遺伝子であり、シグナル強度が十分で、かつ、胎生16日中間帯で3倍以上発現が上昇しその後減少していたSema6cとSyntaphifilinについて、免疫組織学的手法により解析をおこなった。胎生17日齢の胎仔大脳皮質におけるSema6CとSyntaphilinの局在を免疫染色法により観察した結果、中間帯に強く発現していることが認められた。この結果から、マイクロアレイにより得られたSema6CとSyntaphilinの遺伝子レベルでの解析結果は、タンパクの局在とほぼ一致することが確認できた。したがって、脳室帯において子宮内穿孔法により標識された神経細胞では、radial migration中にSema6CやS...
  • 分子標的発見による肝臓強化新療法の基礎的研究, 文部科学省, 科学研究費補助金(萌芽研究),   2005年 - 2006年, 三浦直行, 2系統のRbトランスジェニックマウスを得た。A系統のマウスはトランスジーンを1倍体当たり11コピーもち、B系統のマウスは1倍体当たりトランスジーンを4コピーもっている。今年度は、このトランスジェニックマウスが化学発癌抵抗性を示すかどうかを検討した。化学発癌にはRbトランスジェニックマウス雌とC3H雄のF1(遺伝的背景:B6C3F1)を用いた。生後6週齢のマウスにジエチルニトロソアミンを腹腔内投与し、1週後からフェノバルビタール含有水を35週継続飲水させる。コントロールマウス、Rbトランスジェニックマウス肝臓の病理標本を作製し、腫瘍性病変の性質、悪性度、頻度を検討した。まず、コントロールマウスでは雄、雌とも肝細胞癌が誘導された。雄の発癌性は雌の2-3倍であった。Rbトランスジェニックマウスでは雄雌とも肝細胞癌はまったく認められなかった。次に、結節病変について検討した。コントロールマウスでは雄は平均3.85個の結節を生じるに対し、雌は平均1.70個の結節を生じた。RbトランスジェニックマウスA系統では、雄は平均0.82個の結節を生じ、雌は平均0.33個の結節を生じた。A系統のマウスでは雄雌とも、トランスジェニックマウスは癌抑制性に働いていた。一方、B系統のマウスの雄では、平均0.60個の結節を生じ、雌では平均1.20個の結節を生じた。有意検定をしたところ、B系統では雄のみに有意に...
  • 環境因子がC1^-ホメオスタシス変化を介して皮質神経回路の発達と再生に与える影響, 文部科学省, 科学研究費補助金(基盤研究(B)),   2004年 - 2006年, 福田敦夫, 発達期のプログラムされたCl^-ホメオスタシスがGABAを興奮性に作用させ細胞移動による回路構築を促し、環境刺激によるCl^-ホメオスタシス変化が、神経回路形成や再生にも影響するという仮説の検証を目的とした。まず、GAD67-GFP knock-inマウス胎仔脳へHcRed遺伝子をインビボで導入しradial移動中のglutamate細胞とtangential移動中のGABA細胞を生きた状態で識別する方法を確立した。胎仔脳に豊富に存在するタウリンがGABA_A受容体の内因性アゴニストとして作用して、autocrine的にradial移動細胞に働いたり、paracrine的にtangential移動細胞へのシグナルとなっている可能性が示唆された。細胞移動中に強制発現させたKCC2はin vivoでは機能しないことが示唆された。そこで、Cl^-トランスポーターの転写過程を阻害するshRNAに最適な塩基配列をつデザイン・合成して、shRNA発現プラスミドベクターを構築した。またradial移動に影響を与えるCajal-Retzius細胞を含む辺縁帯の興奮伝播では、GABAがGABA_A受容体の、そしてタウリンがglycine受容体の内在性アゴニストとして働き、しかもNKCC1によって[Cl^-]_iが高く維持されることにより、本来抑制性であるGABA_Aやglycine受容体が興奮...
  • フォークヘッド遺伝子Foxc2による乳癌細胞転移促進作用とその分子機構の解明, 文部科学省, 科学研究費補助金(特定領域研究),   2005年 - 2005年, 三浦直行, 中胚葉発生制御遺伝子Twistが上皮-間葉転換を介して乳癌細胞の転移能を増加させる報告を見て、我々が研究してきたFoxc2遺伝子についても同様な機能があるのではないかと考えた。Foxc2遺伝子は、多くの中胚葉由来組織の発生を制御していることが以前の我々のノックアウトマウスを用いた研究からわかっていた。例えば、体節は最初上皮様構造をとっているが、その後硬節を経て中胚葉細胞に転換し骨格系の前駆細胞になる。まず、マウス乳癌EpRas細胞にFoxc2発現ベクターを遺伝子導入し高発現永久株を樹立した。親株のEpRas細胞やFoxc2高発現株細胞をマウス乳腺皮下の脂肪組織に移植した。約6週後に、原発巣および肺転移の癌を検討した。原発巣の腫瘍サイズや数は親株と高発現株の間に差はなかった。しかし、肺への転移巣の数は親株を移植した場合10個であるのに対し、Foxc2高発現株では40個と4倍になっていた。また、転移巣の癌細胞はFoxc2高発現が持続していた。そこで、Foxc2遺伝子による転移能亢進の分子メカニズムとして上皮-間葉転換がおこっている可能性を明らかにするために、上皮細胞MDCKにFoxc2発現ベクターを遺伝子導入し、永久株を得た。Foxc2高発現細胞における上皮マーカー、間葉マーカーの変化を検討した結果、Foxc2高発現細胞株では、上皮マーカーのE-cadherin, catenin...
  • 会話言語遺伝子FOXP2の高次脳機能における役割の解明, 文部科学省, 科学研究費補助金(特定領域研究),   2005年 - 2005年, 三浦直行, マウスFoxp2染色体遺伝子をまず単離した。この遺伝子は19エキソンからなる全長が300kbp以上の大きい遺伝子であることが判明した。エキソン14をloxPで挟み込んだターゲティングベクターを作製し、マウスES細胞にエレクトロポレーションにて遺伝子導入した。相同的に組み換えを起こしたクローンをサザンブロット法にて判定し、5クローンを得た。現在、キメラマウスを作製中である。メダカFoxP2遺伝子は、マウスFoxp2遺伝子との相同性を用いてクローニングし、全長のcDNAを得ることに成功した。マウスFoxp2蛋白が715のアミノ酸からなるに比し、メダカFoxP2蛋白は766アミノ酸からなることが判明した。構造的特徴であるジンクフィンガー、ロイシンジッパー、フォークヘッドドメインは保存されていた。フォークヘッドドメインのN末側に16個のアミノ酸からなる領域が、C末側に54個のアミノ酸からなる領域が挿入されていた。また、ヒトやマウスに保存されていたポリグルタミン配列が欠失していた。ヒトとマウス間では3アミノ酸が異なるのみであったが、マウスとメダカ間では、20%のアミノ酸が置換していた。メダカにおけるFoxP2遺伝子の発現を抗メダカFoxP2抗体によるホールマウント免疫染色法で観察すると、前脳の一部、中脳の広範囲に強い発現が認められたが、小脳における発現は弱い発現であることが判明した。マ...
  • 大脳皮質回路形成過程の細胞間クロストークにおけるGABAとタウリンの役割, 文部科学省, 科学研究費補助金(特定領域研究),   2005年 - 2005年, 福田敦夫, 1.radial及びtangential移動細胞におけるCl^-トランスポーター遺伝子発現変化の解析[福田・井上・熊田]:GAD67-GFP knock-inマウス脳室帯の新生ニューロンへのHcRed遺伝子の導入を行い、GABA含有量が異なるホモ、ヘテロ、野生型間でradial及びtangential移動の状態を比較したが全く差は見られなかった。さらに、パッチクランプ法でradial移動中のglutamate細胞におけるGABAのdose-response curveを測定したが全く差は無かった。HPLC法を用いてGABAの細胞外濃度を測定したところ、予想通り野生型に比べてヘテロタイプ65%、ホモタイプ7%であった。以上からGABA以外の内因性アミノ酸が代償作用を持つと考え、細胞外タウリン濃度を調べたところGABAの1000-10000倍であり、GABAの1%程度の親和性でGABA_A受容体を介した脱分極を惹起した。すなわち、タウリンがGABA以上にGABA_A受容体の内因性アゴニストとして作用しているため、細胞外GABA濃度が異なるどのgenotypeでもGABA_A受容体やCl^-トランスポーター発現に差が出なかったと考えられた。2.辺縁帯におけるCajal-Retzius細胞/non Cajal-Retzius細胞間のクロストークの解析[福田・Luhmann]:辺縁帯の...
  • 細胞外Cl^-を調節して神経回路の興奮性を制御するグリアのCl^-トランスポーター, 文部科学省, 科学研究費補助金(特定領域研究),   2004年 - 2005年, 福田敦夫, 1.脳スライスのアストロサイトからの[Cl^-]_i測定とグリアによる神経回路機能調節の証明[窪田・福田]:まずアストロサイト親和性色素のsulforhodamine 101を用いて、海馬スライス中のastrocytesを同定した。次にパッチ電極内液にCl^-感受性蛍光色素のMEQを加えておき、同定した多数のastrocytesにsingle-cell electroporation法で次々とMEQを注入し、同時に5-6個のastrocytesでのCl^-イメージングを可能にした。シェーファー側枝をテタヌス刺激した時のastrocytesの[Cl^-]_i変化をこれら複数個のastrocytesで同時に観察した(astrocyte回路網のCl^-イメージング)。シェーファー側枝の高頻度刺激で記録したすべてのastrocyteでMEQ蛍光が低下、すなわち[Cl^-]_i上昇が見られた。これらの[Cl^-]_i上昇は刺激の頻度や強度に応じて変化した。しかしこの変化は、以前我々が報告した錐体細胞でのGABA作用を抑制性から興奮性に逆転させるCl^-蓄積(J.Neurophysiol. 2003)とは時間経過が異なり、静止電位におけるastrocyteのCl^-の電気化学勾配もニューロンと逆向きとの報告もあるので、このastrocyteでの[Cl^-]_i上昇はニューロンとは全く別の...
  • 三叉神経痛モデル動物の作成と痛み情報伝達におけるATP受容体の役割に関する研究, 文部科学省, 科学研究費補助金(基盤研究(C)),   2004年 - 2005年, 上野伸哉, ATP受容体は神経因性疼痛の形成に重要な役割を果たしていることが,明らかとてきた。さらに,中枢神経における主要な抑制性伝達物質であるGABAが,ATP受容体活性化を通じて興奮性に働くことも明らかとなってきた。正常神経細胞においては,細胞内外のClイオン濃度はそれぞれ,10mM以下及び120-130mMを示し,この条件下において,GABAはGABAタイプA受容体活性化によりClイオン流入を引き起こし,膜電位を過分極させる。一方,発達段階や,末梢神経障害により細胞内Clイオン濃度が上昇すると,GABAによりClイオン流出がおこり結果として,膜電位脱分極と細胞興奮が引き起こされる。このようなGABA機能の逆転が神経因性疼痛時におこり,この細胞内Clイオン濃度を調節するトランスポータの役割を電気生理学的およびyeast-two hybridシステムを用い解析した。yeast-two hybridシステムにより神経特異的なKCC2トランスポータが脳型creatine kinaseと相互作用する可能性が資された。そこでHEK293細胞にKCC2を導入し,stable lineを作成し,kinaseをさらに強制発現させ機能解析を行った。電気生理学的手法により,細胞内のCl濃度を測定し,細胞内でKCC2がこのkinaseにより,活性化され,細胞内Clイオン濃度上昇を来すことを明らかとした。ま...
  • 大脳皮質形成期の接線方向移動と放射状移動の細胞間クロストークにおけるCl^‐の役割, 文部科学省, 科学研究費補助金(特定領域研究),   2004年 - 2004年, 福田敦夫, 1.GFPとHcRed標識による接線方向移動細胞と放射状移動細胞の識別[井上・山田・福田]:GAD67-GFP knock-inマウス(C57BL/6j)胎仔にHcRed遺伝子を胎生14日に電気穿孔法で脳室帯の新生ニューロンに導入し、発達の各段階で脳スライスを作成した。接線方向移動中のGABA細胞(GFP蛍光)と放射状移動中のglutamate細胞(HcRed蛍光)が識別できた。放射状移動細胞は大脳皮質II/III層を形成し、接線方向移動細胞は主に中間帯と辺縁帯を移動し、中間帯から皮質版に進入していた。2.radial移動細胞における細胞内Cl^-濃度とCl^-トランスポーター遺伝子発現変化の解析[福田・窪田・山田・Luhmann]:グラミシジン穿孔パッチクランプ法で、放射状移動中のglutamate細胞のGABA/グリシン反応とCl^-平衡電位を測定して、Cl^-トランスポーターとGABA_A/グリシン受容体mRNAのsingle-cell RT-PCRを行った。その発現パターンを各々の細胞の発生時期や移動状態のちがいで比較し、放射状移動細胞の[Cl^-]_i高値と、定着後の[Cl^-]_i低下に伴うGABA_A/グリシン作用の興奮→抑制転換の分子的要因を明らかにした。また、辺縁帯のCajal-Retzius細胞でもグリシン(タウリン)反応と[Cl^-]_iを解析し、グリシ...
  • 内分泌攪乱物質によるCl^-ホメオスタシス破綻と神経細胞移動障害による神経回路異常, 文部科学省, 科学研究費補助金(基盤研究(C)),   2003年 - 2004年, 山田順子, 移動細胞と[Cl^-]_iの測定胎生14日齢のマウス胎仔に電気穿孔法によりGFP遺伝子を導入し、その胎仔の羊水中にトリブチルスズを注入した。トリブチルスズ1μlを注入し、2-3日後の胎仔の様子を観察した。また、生存していた胎仔の脳スライスを作成し、細胞移動の様子を解析した。・1M:胎仔は萎縮して死亡しており、両側のコントロール(電気穿孔とDMSO1μlのみの胎仔、電気穿孔のみの胎仔、何も処置しない胎仔)も死亡していた。・500mM-100mM:胎仔は萎縮して死亡していたが、両側のコントロールは生存していた。・10mM:胎仔は萎縮はしていなかったが死亡しており、両側のコントロールは生存していた。・1mM:胎仔は生存しており、細胞移動も正常であった。トリブチルスズ暴露によるCl^-ホメオスタシスへの影響・[Cl^-]_iへの影響トリブチルスズ暴露による[Cl^-]_iへの影響をみるため、トリブチルスズ30nM3日、処置したグループとコントロールグループの細胞にグラミシジン穿孔パッチクランプ法を適用し、[Cl^-]_iを測定したが、両グループ間で有意な差はみられなかった。・GABA受容体への影響トリブチルスズ暴露によるシナプス電流に変化が見られたことから、GABA_A受容体が変化していることが考えられる。トリブチルスズ30nM3日間暴露した細胞群とコントロール群の細胞のmRNAを抽...
  • てんかん原性皮質形成異常におけるCl^-ホメオスタシスとGABA機能異常の分子機構, 文部科学省, 科学研究費補助金(萌芽研究),   2002年 - 2004年, 福田敦夫, 1.ヒト皮質異形成組織標本におけるreelin遺伝子発現変化の解析(福田、井上):Reelinは大脳皮質第一層に存在するCajal-Retzius細胞から分泌され、大脳皮質の神経細胞の配置決定に重要な役割を果たしていると考えられる。大脳皮質形成異常は発生異常に基づく神経細胞の配列や形態異常などの組織像を示すので、難治の部分てんかんに対する外科治療により摘出された皮質形成異常標本を用いてreelin遺伝子の発現変化をin situ hybridization組織化学法を用いて検討した。コントロールとして摘出標本内の組織学的な形成異常がない部位を用い、比較定量的な解析を行ったところ、reelin mRNAが形成異常部位において有意に減少していた。2.皮質形成異常動物モデル標本を用いた異常層構造形成過程の解析(福田、井上、窪田、Luhmann):異常な皮質層構造の形成過程における興奮性GABA/グリシン作用の要因について検討するため、ラットの皮質凍結損傷モデルを用いて、異常皮質形成過程で損傷部位へ移動中の細胞におけるGABA_A受容体、グリシン受容体、Cl^-トランスポーターのmRNAの発現量変化をin situ hybridization法を用いて解析した。凍結損傷4日後の移入細胞でNKCC1が増加、逆にKCC2が減少しており、[Cl^-]_i上昇の原因と考えられた。これらの変化...
  • 大脳新皮質形成過程におけるカハール・レチウス細胞と皮質板細胞のクロストーク, 文部科学省, 科学研究費補助金(特定領域研究),   2003年 - 2003年, 福田敦夫, 1.マウス胎仔脳への電気穿孔法を用いたEGFP遺伝子導入による移動細胞の可視化(井上、山田、福田):分化直後の神経細胞に特異的にEGFPを発現させて移動過程を可視化する為、子宮内胎仔へのin vivo電気穿孔法により遺伝子導入を行った。すなわち、胎齢13日のマウス胎仔の側脳室にCAGプロモーターにEGFPあるいはDsRed2遺伝子を繋いだプラスミドを注入し、パルス電圧を加え脳室帯で分化直後の神経細胞に遺伝子導入した。これらの細胞がEGFP/DsRed2の蛍光を発しながら脳室帯から皮質板へ移動してinside-outの細胞配置により皮質を形成することを経時的に確認できた。これにより、細胞の発生時期を蛍光で識別することが可能になった。2.皮質板細胞でのCl^-ホメオスタシス調節遺伝子群発現バランスと細胞移動の解析(山田、岡部、福田):子宮内胎仔へのin vivo電気穿孔法により、分化直後の細胞(EGFP蛍光)にKCC2遺伝子を強制発現させ、[Cl^-]_iを低下させた細胞で細胞移動に変化があるかを調べた。まだ例数が少ないため、結論を得るために今後例数を増やす。グラミシジン穿孔パッチクランプ法でCl^-平衡電位を測定し、実際に[Cl^-]_iが低下していることを確認して、移動や[Cl^-]_iとの関係を明らかにする。3.辺緑帯におけるCajal-Retzius細胞間のクロストークの...
  • てんかん原性大脳皮質形成異常モデル動物の確立とアンチセンス治療法への展開, 文部科学省, 科学研究費補助金(基盤研究(B)),   2000年 - 2003年, 福田敦夫, 部分てんかんの原因として注目されている皮質形成異常は、神経細胞の発生・分化・移動の過程で生じた異常であり、神経細胞の配列や形態異常などの組織像を示すとともに病変自体がてんかん原性を有している。本研究課題では、皮質形成異常の成因やそのてんかん原性にCl^-ホメオスタシス異常によるGABA作用の過分極/脱分極の逆転が関わっている可能性を検討することを目的とした。まず、focal freeze-lesionによる局所的細胞移動障害モデルを作成し、Cl^-トランスポーター、GABA及びグリシン受容体サブユニット、細胞移動関連分子などのmRNAの発現変化をin situ hybridization法を用いて検討し、機能的変化をCa^<2+>イメージングやグラミシジン穿孔パッチクランプ法で解析した。その結果を、正常発達過程のラットやキンドリングモデルと比較して、細胞移動や層構造の異常及び発作波様異常興奮におけるCl^-ホメオスタシス、GABA/グリシン作用や電気生理学的特性の役割を解析した。次いでヒトてんかん原性皮質形成異常摘除組織でのCl^-トランスポーター(NKCC1=Cl^-取込,KCC2=Cl^-排出)と細胞移動関連分子(reelin)のmRNAの発現変化の解析を行い、モデル動物と比較した。その結果、モデル動物の異常皮質形成過程ではNKCC1発現上昇とKCC2発現低下、それに伴う...
  • 大脳新皮質形成過程におけるカハール・レチウス細胞と皮質板細胞のクロストーク, 文部科学省, 科学研究費補助金(特定領域研究),   2002年 - 2002年, 福田敦夫, 1.ラット胎仔脳への電気穿孔法を用いたEGFP遺伝子導入による移動細胞の可視化(井上、山田、福田):移動中の細胞に特異的にEGFPを発現させて移動後の細胞と識別する為、ラット胎仔を用いて、CMVプロモーターによるEGFP発現プラスミドを用いた遺伝子導入を電気穿孔法により行った。しかし、有効な遺伝子発現が得られず、プロモーターをEF1に変更しても同様であった。そこで、マウス胎仔を用いてCAGプロモーターによる遺伝子導入を行ったところ、脳室帯の細胞にEGFPの蛍光を確認できた。今後は移動中の細胞のみを識別することを可能にするため、各種プロモーターによる発現時期の違いを検討する。2.Cajal-Retzius細胞の生理学的特性と辺縁帯におけるシグナル伝達の解析(福田、岡部、Luhmann):辺縁帯のtanential sliceを作成し、グラミシジン穿孔パッチクランプ法でCaial-Retzius細胞のグリシン応答と[Cl^-]_iを記録した後、Cr^-トランスポーターのKCC2(Cl^-排出)とNKCC1(Cl^-取込)及びglycine受容体subunit(alpha1,alpha2,beta)mRNAのsingle-cell RT-PCRを行って単一細胞でのそれぞれの発現パターンを解析した。Cajal-Retzius細胞では皮質板細胞に比べてNKCC1の発現が優位で、[Cl^...


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