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Advance

HIRASHIMA Naohide

    Graduate School of Pharmaceutical Sciences Department of Cellular Biophysics　Professor
Contact： hirashimphar.nagoya-cu.ac.jp
Last Updated :2024/04/28

Researcher Information

URL

J-Global ID

Research Interests

  • 可視化解析   人工細胞   分泌   マスト細胞   エクソサイトーシス   アレルギー   

Research Areas

  • Nanotechnology/Materials / Nano/micro-systems
  • Nanotechnology/Materials / Nanobioscience
  • Life sciences / Pharmaceuticals - analytical and physicochemistry
  • Life sciences / Cell biology
  • Life sciences / Biophysics

Academic & Professional Experience

  • 2006/04 - Today  Nagoya City UniversityGraduate School of Pharmaceutical Sciences, Department of Cellular Biophysics教授
  • 2013/04 - 2017/03  Nagoya City UniversityGraduate School of Pharmaceutical Sciences薬学研究科長（学部長兼任）
  • 1998/01 - 2006/03  Nagoya City UniversityMedicin助教授
  • 1994/08 - 1998/12  The University of TokyoFaculty of Pharmaceutical Sciences助手
  • 1986/10 - 1994/07  Kyushu UniversitySchool of Pharmaceutical Sciences助手

Education

  • 1986/04 - 1996/09  東京大学大学院  薬学系研究科博士後期課程
  • 1984/04 - 1986/03  東京大学大学院  薬学系研究科博士前期課程
  • 1980/04 - 1984/03  The University of Tokyo  Faculty of Pharmaceutical Sciences

Association Memberships

  • The American Society for Cell Biology   JAPANESE SOCIETY OF ALLERGOLOGY   BIOIMAGING SOCIETY   THE JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY   THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN   THE BIOPHYSICAL SOCIETY OF JAPAN   THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN   

Published Papers

Books etc

  • 楯, 直子; 平嶋, 尚英 (Joint work)培風館 2021/09 9784563085681 vi, 269p
  • 物理系薬学Ⅲ
    平嶋 尚英 (Joint work)東京化学同人 2016/11
  • 薬学生のための基礎シリーズ７ 基礎化学
    培風館 2014 9784563085575
  • 免疫学辞典
    平嶋 尚英 (Joint workイオノマイシン)東京化学同人 2001
  • 医学＆サイエンスシリーズ 細胞内シグナル伝達がわかる
    平嶋 尚英 (Joint workCa2+のシグナル伝達における役割)羊土社 2000
  • 情報生物学シリーズ３．カルシウムシグナリング
    平嶋 尚英 (Joint workカルシウムの物理化学的性質)培風館 1997

MISC

Awards & Honors

  • 2000/03 日本薬学会 日本薬学会奨励賞
     神経・免疫系におけるエクソサイトーシスの分子機構 
    受賞者: 平嶋 尚英

Research Grants & Projects

  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2022/04 -2025/03 
    Author : 鈴木 亮; 平嶋 尚英
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
    Date (from‐to) : 2020/07 -2023/03 
    Author : 平嶋 尚英
     
    人工系（細胞サイズの巨大リポソーム）と生細胞系（好塩基球 RBL-2H3）の融合
    巨大リポソームと好塩基球の融合を、細胞融合装置(ECFG21、ネッパジーン)を、Saitoらの方法を用いて行った。Saitoらの実験条件では、融合のための直流パルスの印加によって細胞サイズの巨大リポソームが壊れることが判明したため、まずは、直流パルスの印加によって巨大リポソーム崩壊が誘導されない直流パルスの条件を決定した。 次に、巨大リポソームの膜を蛍光色素NBDで標識したホスファチジルエタノールアミン(NBD-PE)で可視化し、RBL-2H3と融合させた。交流電圧、直流パルスの条件を検討し、いくつかの条件で、巨大リポソームとＲＢＬ細胞が融合したように見える条件を見出した。しかしながら、蛍光顕微鏡による蛍光標識リン脂質のRBL細胞膜への拡散が認められず、巨大リポソームとＲＢＬ細胞の融合の確証が得られなかった。 そこで、ＲＢＬ細胞の方も蛍光で可視化するために、ＲＢＬ細胞に含まれる分泌顆粒を赤色蛍光リソトラッカーで染色して融合させたが、分泌顆粒の巨大リポソーム内への拡散が認められず、融合の確証が得られなかった。 現在、ＲＢＬ細胞をHoechst33342で核染色し、巨大リポソームは膜をNBD-PEで、内部の水層を水溶性の蛍光色素であるカルセインで染色し、巨大リポソームとＲＢＬ細胞の融合を３種の蛍光色素の位置関係を解析することによって検証する系の確立を行っている。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2019/04 -2022/03 
    Author : Suzuki Ryo
     
    Allergies are increasing in worldwide. There are many causes of allergy, and symptoms vary from mild to potentially life threatening. Mast cells (MCs) play an important role in allergic diseases. MCs contain many granules comprising various inflammatory mediators. However, the underlying mechanisms of the relationship between distinction of inflammatory mediator secretion in MCs and diversity of allergic reactions are still unknown. We observed the distribution of inflammatory mediators (e.g. TNFα, CCL2, or histamine) in the granules and different VAMPs, which is involved in mediator release. We found that each mediator and VAMP was located in different granules. Using VAMPs knockdown MC, we identified specific VAMP for b-hexosaminidase (i.e. histamine) release. Our observations suggested that each single granule contain specific inflammatory mediators. Thus, this may cause the diversity of allergic responses.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 2018/04 -2021/03 
    Author : Hirashima Naohide
     
    We found that one of the subtypes of the calcium channel Orai, which is essential for the secretion of inflammatory mediators from mast cells, is expressed on secretory granules that store and secrete mediators. We examined the possibility that secretory granules work as an intracellular Ca2+ store and contribute to the increase in intracellular Ca2 + concentration by stimulating mast cells. We have succeeded in developing a fluorescent protein-based probe that monitors Ca2+ concentration in secretory granules. However, no decrease in intracellular Ca2+ concentration, which was expected to occur with an increase in intracellular Ca2+ concentration associated with mast cell stimulation, was observed.
  • 分泌細胞における新しいカルシウムストアとＣａ２＋放出の誘導機構
    文部科学省：科学研究費補助金
    Date (from‐to) : 2018 -2021 
    Author : 平嶋 尚英; 大学院薬学研究科
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 2016/04 -2019/03 
    Author : Suzuki Ryo; HIRASHIMA Naohide; NAKAMURA Ryosuke
     
    Mast cells (MCs) initiate allergic reactions. These cells express an antigen-specific IgE-bound high-affinity receptor for IgE (FcεRI) that binds to IgE. The interaction of an allergen with IgE-FcεRI is an essential step in MCs activation as well as subsequent allergic responses. It has long been recognized that antigens bind to IgE antibodies with variable affinities. When allergen binds to IgE with different affinities, a wide range of allergic responses is triggered. Here we unravel how a difference in the affinity of antigen regulates intracellular signaling pathways and intercellular communication with other immune cells. The mechanisms of allergen affinities on allergic responses is the important factor to develop new therapeutic tools with increased efficacy.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
    Date (from‐to) : 2015/04 -2018/03 
    Author : Suzuki Ryo; HIRASHIMA NAOHIDE
     
    To investigate the molecular mechanism of ORAI-2 localized on mast cell secretory granules, we tried to observe localization of ORAI isoforms (ORAI-1 and -2) in tissue mast cells. We found that ORAI-2 were localized on secretory granules although ORAI-1 were localized in the plasma membrane in tissue mast cells. Next, we examined the interaction of ORAI-2 proteins with STIM and tubulin. Co-immunoprecipitation experiment revealed that interaction of ORAI-2 with STIM and tubulin were increased after IgE/antigen stimulation. We also found that ORAI-2 localized on mast cell secretory granules played an important role in exocytosis by fluorescent protein-based biosensor analysis.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2014/04 -2017/03 
    Author : Hirashima Naohide
     
    In this study, we tried to develop the exocytosis-like secretion system that secretes intra-vesicular content in response to the recognition of specific molecule. To construct such a system, we tried to introduce Ca channel Orai-1 into a cell-sized giant liposome. Orai-1 was expressed in E.coli and we succeeded in isolation and purification of Orai-1. We tried various ways to reconstitute the channel into the liposome, such as changing phospholipids that form liposomes and changing the preparetion methods of giant liposmes. However, we could not reconstitute enough channels into liposomes.
  • 単一巨大リポソームによる開口放出様の膜融合の可視化解析
    Date (from‐to) : 2015 -2017 
    Author : 田所 哲; 帝京; 学; 薬学部
  • ビデオレート生物発光イメージング法による骨形成関連タンパク質の分泌動態解析
    Date (from‐to) : 2014 -2017 
    Author : 鈴木 崇弘; 歯学部
  • 小脳プルキンエ細胞におけるリアノジン受容体を介した樹状突起形成制御機構の解明
    Date (from‐to) : 2013 -2016 
    Author : 田中 正彦; 薬学研究科
  • 次世代バイオ・ナノ遺伝子ベクターの構築と医療薬学への展開
    Date (from‐to) : 2012 -2016 
    Author : 中西 守; 愛知; 薬学部
  • 人工エキソ／エンドサイトーシス系の界面解析と標的特異的分泌／取り込み系への展開
    Date (from‐to) : 2013 -2015 
    Author : 田所 哲; 帝京; 学; 薬学部
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2011 -2013 
    Author : HIRASHIMA Naohide
     
    Mast cells play an essential role in allergic responses by secreting inflammatory mediators. The exocytotic secretion of these mediators (degranulation) is triggered by the increase in intracellular Ca2+ concentration. The main pathway for the entry of extracellular Ca2+ across the plasma membrane is store-operated Ca2+ entry through Ca2+ release-activated calcium (CRAC) channels. For Orai, one of CRAC channels,there are three isoforms, Orai, Orai-1, -2 and -3. Orai-1 is responsible for degranulation in mast cells. We found that Orai-2 was mostly localized on secretory granules, while Orai-1 and -3 were localized on the plasma membrane in mast cells. When Orai-2 was knocked down, Ca2+ release from Ca2+ store was significantly attenuated but that induced by thapsigargin was not affected. When cells were stimulated with antigen, degranulation was significantly inhibited in knockdown cells. These results suggest that Orai-2 regulates degranulation through Ca2+ release from Ca2+ store.
  • 細胞サイズのプロテオリポソームを用いた人工分泌細胞の刺激-分泌連関
    Date (from‐to) : 2011 -2012 
    Author : 田所 哲; 薬学研究科
  • グルタミン酸脱炭酸酵素の誘導型遺伝子欠損マウスを用いたGABA神経伝達機構の研究
    Date (from‐to) : 2010 -2012 
    Author : 柳川 右千夫; 医学系研究科
  • 小脳プルキンエ細胞が複雑かつ秩序立った形態の樹状突起を形成する分子機構の解析
    Date (from‐to) : 2010 -2012 
    Author : 田中 正彦; 名; 薬学研究科
  • 免疫・神経クロストークの分子イメージングと医療への展開
    Date (from‐to) : 2008 -2011 
    Author : 中西 守; 愛知; 薬学部
  • 顕微光学法による神経-免疫シナプス構築の分子機構とその機能解析
    Date (from‐to) : 2008 -2010 
    Author : 古野 忠秀; 薬学部
  • グルタミン酸脱炭酸酵素の遺伝子改変マウスを利用したGABA神経伝達機構の研究
    Date (from‐to) : 2006 -2008 
    Author : 柳川 右千夫; 医学系研究科
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 萌芽研究
    Date (from‐to) : 2006 -2008 
    Author : 中西 守; 古野 忠秀; 平嶋 尚英
     
    生体への安全で効率的な遺伝子製剤によるナノデリバリーシステムの開発は、遺伝子治療や再生医療の基盤となる重要な研究課題である。本研究では正電荷コレステロール誘導体を素材とした非ウイルスベクター(正電荷リポソーム)の開発・推進とナノデリバリーシステムの独創的な構築を行った。非ウイルスベクターとしてコレステロール骨格の側鎖末端に水酸基を持つ誘導体を開発し、また、これら非ウイルスベクターに微生物が産生する界面活性物質(バイオサーファクタント; MEL-A)を包摂させると遺伝子導入効率が顕著に増大することを明らかにした。また、レーザ顕微光学技術を駆使して、標的細胞への遺伝子導入の分子メカニズムを追究した。その結果、バイオサーファクタント包摂正電荷リポソームは、標的細胞の形質膜(細胞膜)との膜融合を促進させ、細胞質内に移行後はバイオサーファクタント(MEL-A)が細胞内膜系との膜融合を促進させつつ、効率のよく、遺伝子を核内に輸送することを分子イメージング法により解明した。この新技術は安全性が高く、遺伝子導入効率においても既存の非ウイルスベクターを大きく凌駕しており、ナノバイオ医療の推進につながると判断された。また、本技術はin vivoでも効率的なナノ遺伝子ベクターであることを明らかにした。さらに、再生医療の基盤技術と結びつけるため、ES細胞を神経細部へ特異的に分化誘導にする手法の開発を行った。そして、テトラサイクリンの存在下で、ES細胞の転写活性をスイッチングするTet-on systemの開発に成功し、マウスES細胞を効率よく神経細部へ分化する技術を確立した。この新技術とバイオサーファクタント(MEL-A)包摂非ウイルスベクターによる遺伝子導入技術とを組み合わせて、先端医療(遺伝子治療、再生医療)ヘナノ遺伝子ベクター法の展開に成功した。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 2006 -2008 
    Author : HIRASHIMA Naohide; TANAKA Masahiko; TADOKORO Satoshi
     
    生体では神経伝達物質やホルモンなど様々な細胞から多様な生理活性物質が分泌される。開口放出はその分泌機構の中で最も重要なものである。神経細胞では、神経伝達物質が細胞膜近傍のアクティブゾーンと呼ばれる特殊な構造から分泌されるが、このような構造が神経細胞以外の細胞で、存在しかつ機能するかどうか不明であった。我々はマスト細胞というアレルギー誘発物質を分泌する細胞では、ELKSと呼ばれるタンパク質が刺激後細胞膜付近に移動して、分泌を正に制御することを明らかにした。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 特定領域研究
    Date (from‐to) : 2006 -2007 
    Author : 平嶋 尚英
     
    平成19年度は,昨年度開発したエクソサイトソーム改良と大リポソーム内のCaイオン濃度上昇による内包小リポソーム膜と大リポソーム膜との膜融合誘導を試みた。 (1)エクソサイトソーム(小リポソーム内包大リポソーム)の改良 Yamazakiらの方法により小リポソーム含有のGiant liposomeを作成した。作成条件を検討することによって,1ステップで小リボソーム含有のGiant liposomeが多数生成する条件を見出した。一方,Giant liposome作成時に別途調製した小リポソームをまぜる2ステップ法では,内包小胞をエクストルーダによってサイズをそろえることによって,粒径の均一な小胞含有Giant liposomeを作成できた。 (2)Caイオノフォアによる刺激応答 Giant liposomeのCa濃度を上昇させるために,Giant liposomeにCaイオノフォアであるイオノマイシンを導入した。Giant liposome内にCa感受性蛍光色素であるOregon green BAPTAを導入した。外液のCaイオン濃度を上げることによって,リポソーム内にCaイオンを導入した。実際,Ca感受性蛍光色素の蛍光強度変化が観測された。しかし,多くの場合Ca濃度上昇後のGiant liposomeの安定性が著しく低下した。次に,Giant liposome内のCaイオン濃度上昇により内包小リポソームと大リポソームの膜融合を誘導するために,負電荷をもつリン脂質ホスファチジルセリンを含有した脂質組成でエクソサイトソームを調製した。イオノフォアと外液Ca濃度の上昇による刺激により,一部のエクソサイトソームで,内包小リポソームと大リポソームの融合による内包リポソームの消失に伴う蛍光強度の現象が観測された。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 萌芽研究
    Date (from‐to) : 2006 -2007 
    Author : 平嶋 尚英; 田中 正彦
     
    ラット好塩基球株(RBL2H3細胞)は、細胞表面にIgE受容体をもち、この受容体DNP (dinitrophenyl)基を認識するIgEを結合させることによって、DNP基で修飾したCHO細胞を特異的に認識し、それに向かって分泌する系を構築した。CHO細胞にはあらかじめ分泌されたヒスタミンに応答するようにヒスタミン受容体(H1受容体)を発現させた。。 ヒスタミン受容体(H1受容体)を発現させたCHO細胞は、ヒスタミンに反応し、細胞内のCaイオン濃度上昇がおきることを確認した。 CHO細胞のDNP基修飾は、弱アルカリ性存在下に、DNBS(dinitro-benzene-sulfonic acid)と混ぜ、37℃でインキュベーションすることによって、細胞表面のアミノ基にラベルすることによって行ったが、細胞毒性が強くラベルできなかった。そこで、リン脂質であるホスファチジルエタノールアミン(PE)にDNP基を修飾し、CHO細胞の細胞膜に取り込ませる方法を試みた。その結果、細胞膜をほぼ均一にDNP-PE修飾できた。 そこで、あらかじめFura-RedをロードしたDNP修飾したヒスタミン受容体安定発現CHO細胞とDNP修飾をしていないヒスタミン受容体安定発現CHO細胞に対して、抗DNP-IgEを結合させたRBL2H3細胞を加えた。しかしながら、DNP修飾したCHO細胞において、RBL細胞から分泌されたヒスタミンによって細胞内のCa濃度上昇が見られた細胞は検出できなかった。 ラベルしたDNP量や細胞間のコンタクトの強度を考慮して再検討を行う必要がある。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 特定領域研究
    Date (from‐to) : 2005 -2006 
    Author : 平嶋 尚英
     
    昨年度(17年度)は、マスト細胞におけるアクチン線維基盤とする分泌小胞の輸送機構ついて、研究を行った。本年度(18年度)は、より長距離の輸送を担うと考えられる微小管を基盤とした分泌小胞の輸送について検討を加えた。また、マスト細胞における分泌小胞と細胞膜の融合部位の特徴的な構造を明らかにすべく、アクティブゾーンタンパク質として重要な役割を果たすタンパク質であるELKSの発現と機能解析を行った。 (1)マスト細胞における微小管上の分泌小胞輸送機構 微小管上の輸送は、モータータンパク質としてはキネシンとダイニンが担当しているが、細胞中心部から細胞膜周辺への分泌小胞輸送機構を明らかにするために、キネシンの発現について調べたところ、KIF1A、KIF2、KIF3Aの発現が明らかとなった。 現在、RNAiを用いた各KIFのノックダウン株の作成を行っている。KIF3Aのノックダウンによって若干のエクソサイトーシスの阻害が認められた。 また、現在分泌小胞とKIFをつなぐタンパク質として、免疫沈降法によってKAP3およびRabタンパク質を網羅的に解析している。 (2)マスト細胞におけるアクティブゾーンタンパク質ELKSの発現と機能解析 神経細胞のアクティブゾーンタンパク質であるELKSは、同じくアクティブゾーンタンパク質であるbassoon、piccolo、RIMと結合し、極めて重要な役割を果たしている。そこで、まずマスト細胞での発現を確認したところ、RT-PCRおよびウエスタンブロットによってその発現が確認された。次にRNAiでELKSをノックダウンしたところ、50%程度の発現低下では、エクソサイトーシスに有意の減少は認められなかった。今後、さらに発現を落として、エクソサイトーシスや分泌小胞の動態を追究する。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 萌芽研究
    Date (from‐to) : 2005 -2005 
    Author : 平嶋 尚英; 古野 忠秀; 中西 守
     
    平成16年度は、蛍光タンパク質のYFPを細胞膜へアンカーする方法としてGAP43のN末端配列を付加することによって細胞膜のラフト領域に局在化させることに成功した。また、Gタンパク質KrasのC末端配列を付加することによって非ラフト領域に局在化させることにも成功した。平成17年度は、ラット好塩基球株(RBL-2H3)とチャイニーズハムスターオバリー細胞(CHO)を用いて実験を行った。 (1)エクソサイトーシスに伴う膜脂質の動態の追究 GAP43のN末端配列を付加することによって細胞膜のラフト領域に局在化させたRBL2H3細胞を用いて、NBD標識したホスファチジルセリン(PS)とホスファチジルエタノールアミン(PE)を加えて、エクソサイトーシスに伴う、リン脂質の分布を調べた。その結果、エクソサイトーシスを誘導後、約5分でPS、PEともに細胞外側に移動することが明らかとなった。また、このような変化は、KrasのC末端配列を付加したYFPでも見られたが、GAP43のN末端配列を標識した場合の約50%にとどまっていた。これらのことは、エクソサイトーシスがラフト領域で主に起こっていることを示唆する。 (2)アポトーシスに伴う膜脂質の動態の追究 NBD標識PSしたCHO細胞を用いて、アポトーシスに伴う膜脂質の動態を調べた。アポトーシスを誘導させたが、ラフトおよび非ラフト領域のどちらの場合もPSの動態に大きな変化は認められなかった。アネキシンVを用いて細胞外側へのPSの露出は確認できた。従って、CHO細胞の場合はYFPを用いた測定系が機能していないと推察された。現在、原因を追究している。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 2003 -2005 
    Author : NAKANISHI Mamoru; HIRASHIMA Naohide; FURUNO Tadahide; TESHIMA Reiko
     
    Communication between nerves and mast cells is a prototypic demonstration of neuro-immune interaction. Previously, we showed clearly that nerve-mast cell cross-talk can occur bidirectionally in the absence of an intermediary transducing cell using an in vitro co-culture approach and calcium imaging. In terms of bidirectional communication, we demonstrated that the neuropeptide substance P is an important mediator in efferent communication (i.e. neuron-to-mast cell), but the mediators in afferent communication (i.e. mast cell-to-neuron) have been still unknown. Then, we have studied the mediators to activate neurites (superior cervical ganglia ; SCG) cocultured with mast cells (rat basophilic leukemia cells ; RBLs). Addition of antigen to the cocultures of SCG and RBLs elicited the increase in the [Ca^<2+>]_i in RBLs and after a lag period induced the increase in the [Ca^<2+>]_i in SCG neuretes extending at a long distance (>150μm) from the site where the RBLs attached to the neurites. The pretreatment of pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2',4'-disulfonic acid (PPADS) or apyrase, which is a purinergic receptor 2 antagonist or an ATP hydrolyzing enzyme, respectively, prevented the calcium signals in SCG neuritis which were resulted as a consequence of RBL activation, but the pretreatment of chlorophenilamine or ketanserin, which is a histamine or serotonin receptor antagonist, respectively, did not. These results indicated that the ATP released from activated mast cells functioned as an important mediator in afferent communication between neurites and mast cells, but not histamine and serotonin. In addition, we found the roles of SynCAM and N-cadherin in the synaps-like structures between mast cells and neuritis.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 特定領域研究
    Date (from‐to) : 2004 -2004 
    Author : 中西 守; 平嶋 尚英; 古野 忠秀
     
    遺伝子治療は遺伝病の根元的治療法になるだけでなく、癌やエイズの治療にも有効である。しかし、病原性ウイルスベクターによる遺伝子治療においては、不慮な事故例も報告されている。この問題を解決するため、研究代表者らは正電荷コレステロール誘導体を素材とした安全性の高い非ウイルスベクター(正電荷リポソーム)の開発に取り組んできた。代表者らの新規ベクターは高い安全性はもちろんのこと、遺伝子導入効率においても既存の非ウイルスベクターを大きく凌駕した。その上、正電荷リポソームにバイオ・サーファクタントを含有させると遺伝子導入効率が飛躍的に増大することを発見した。また、本年は、バイオサーファクタントMEL-Aに含まれる2個の脂質残基が不飽和にすると、飽和の場合と比較して、遺伝子導入効率が100倍以上も増大するというも画期的な研究成果をえた。そこで、このバイオ・サーファクタント含有リポソームの遺伝子治療に応用するための基礎データの蓄積、遺伝子導入機構の解明、ならびに、動物を用いた遺伝子治療の実験を行った。その結果、(1)バイオ・サーファクタントの分子構造(分子種)により遺伝子導入の効率が大きく増大することを発見した。(2)不飽和脂肪酸誘導体が画期的な遺伝子導入効果を与える。(3)共焦点レーザ顕微鏡を用いた実験から、MEL-Aはカプセル化した正電荷リポソーム・DNA複合体の細胞膜への吸着、細胞内への取り込み過程を顕著に促進した。(4)担がんマウスの実験から、バイオ・サーファクタント含有正電荷リポソームは遺伝子治療の研究に大きく寄与し、非ウイルスベクターとしてのがん遺伝子治療に有用である等の多くの画期的成果を得た。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 特定領域研究
    Date (from‐to) : 2003 -2003 
    Author : 中西 守; 古野 忠秀; 平嶋 尚英
     
    アデノシンデアミナーゼ欠損症(ADA欠損症)の患者に対して試みられた遺伝子治療の研究は、新しい医療の幕開けを告げるものであった。それ以来、遺伝子治療は遺伝病の根元的治療法になるだけでなく、癌やエイズの治療にも有効であると期待されており、今後の重要な医療技術の一つになることは間違いないであろう。しかし、遺伝子治療を受ける患者数の増加とともに、病原性ウイルスをベクターとして用いた場合の不慮事故の報告数が増加の一途をたどっている。この問題を解決するため、研究代表者らは正電荷コレステロール誘導体を素材とした安全性の高い非ウイルスベクター(正電荷リポソーム)の開発に取り組んできた。代表者らの新規ベクターは高い安全性はもちろんのこと、遺伝子導入効率においても既存の非ウイルスベクターを大きく凌駕した。その上、正電荷リポソームにバイオ・サーファクタントを含有させると遺伝子導入効率が飛躍的に増大することを発見した。そこで、このバイオ・サーファクタント含有リポソームの遺伝子治療に応用するための基礎データの蓄積、遺伝子導入機構の解明、ならびに、動物を用いた遺伝子治療の実験を行った。その結果、(1)バイオ・サーファクタントの分子構造(分子種)により遺伝子導入の効率が大きく増大することを発見した。(2)中でも、バイオ・サーファクタントMEL-Aが最も高い遺伝子導入効率を与えた。(3)共焦点レーザ顕微鏡を用いた実験から、MEL-Aはカプセル化した正電荷リポソーム・DNA複合体の細胞膜への吸着、細胞内への取り込み過程を顕著に促進した。(4)担がんマウスの実験から、バイオ・サーファクタント含有正電荷リポソームは遺伝子治療の研究に大きく寄与すると考えられた。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 特定領域研究
    Date (from‐to) : 2002 -2003 
    Author : 中西 守; 古野 忠秀; 平嶋 尚英
     
    本研究では、バイオ・サーファクタント(微生物が産生する機能性脂質)の一つである糖脂質系のバイオ・サーファクタントMEL-A(mannosylerythritol lipid A)が、正電荷リポソームによる外来遺伝子の導入効率を著しく増大させることを明らかにし、この分野の研究にbreak-throughをもたらすとともに、特許を取得するに至った。さらにその導入効率増大の機構を明らかにするために、正電荷リポソームと外来遺伝子を単一細胞レベルでの可視化解析を行った。具体的には、その結果、(1)バイオ・サーファクタントを用いた高効率の非ウイルスベクターの開発。(2)バイオ・サーファクタントによる遺伝子導入機構の解明。さらに、(3)非ウイルスベクターによる外来遺伝子の導入機構(エンドサイトーシス、膜融合、核シグナルの寄与)の解明等を行った。これらの結果は、バイオ・サーファクタントが非ウイルスベクター(正電荷リポソニム)の遺伝子導入効率を顕著に上昇させる画期的な分子(物質)である。また、バイオ・サーファクタント含有リポソームの細胞内取り込みは、エンドサイトーシスを介在したものであるが、バイオ・サーファクタントの存在は標的細胞膜とリポソーム膜との融合を促進することにより導入効率を画期的に上昇させることが明らかになった。 上述のように、本研究で得られた結果は、バイオ・サーファクタントを用いた遺伝子導入のもつ可能性が極めて高いことを示唆するとともに、安全性の極めて高い遺伝子導入の非ウイルスベクターが開発されたと結論でき、がんの遺伝子治療に向けた新規非ウイルスベクターとして今後臨床面で大いに利用されるものと判断された。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2002 -2003 
    Author : SUZUKI Ryo; HIRASHIMA Naohide; NAKANISHI Marnoru
     
    The MAP kinase cascade is essential for signaling of various extracellular stimuli to the nucleus. Stimulation of T cells, B cells, and mast cells through aggregation of antigen receptors and other stimulants results in activation of MAP kinase. In this study, we focused on the dynamics of MAP kinase (MAPK) cascade protein in mast cells using yellow fluorescent protein (YFP)-tagged MAPK (ERK2) and YFP-tagged MAPKKK (Raf-1). Here, we have shown many aspects of MAP kinase signaling in immune response. 1.In wild type mast cells, the membrane translocation of MAPKKK (Raf-1) reached 〜3 min after antigen stimulation, and thereafter the nuclear import of MAPK (ERK2) reached the maximum at 5〜7 min Raf-1 did not co-localize with lipid microdomain. 2.In the presence of leptomycin B (inhibitor of nuclear export), the export of ERK2 became more slowly though ERK2 was imported to the nucleus as like as in non-treated cells. 3.We have studied the effects of FcγRIIB on the FcεRI-mediated nuclear shuttling of MAP kinase in immune cells. The co-clustering of FcεRI and FcγRIIB increased the [Ca-<2+>]_i and induced the nuclear import of ERK2. However, the calcium increase was transient and ERK2 was rapidly exported to the cytoplasm. 4.We have studied the effects of two tyrosine phosphatases, HePTP (a tyrosine-specific phosphatase) and VHR (a dual specificity protein-tyrosine phosphatase), on the FcεRI-mediated nuclear shuttling of ERK2 in the mast cells. In HePTP-overexpressing cells, the maximal amount of ERK2 accumulated in the nucleus was much less than that in wild type cells though the nuclear import of ERK2 reached the maximum in the similar time-course. In VHR-overexpressing cells, the amount of imported ERK2 decreased more rapidly though ERK2 was imported to the nucleus as like as in wild type cells. Thus we succeeded to show the molecular mechanism of MAP kinase cascade protein in immune response.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 萌芽研究
    Date (from‐to) : 2002 -2003 
    Author : 中西 守; 北本 大; 古野 忠秀; 平嶋 尚英
     
    遺伝子治療は21世紀の新しい医療の柱の一つとして位置づけられている。遺伝子治療は遺伝病の根元的治療法になるだけでなく、癌やエイズの治療にも有効であると期待されており、重要な医療技術の一つになることは間違いないであろう。しかし、遺伝子治療を受ける患者数の増加とともに、病原性ウイルスをベクターとして用いた場合の不慮事故の報告数が増加の一途をたどっている。この問題を解決するため、研究代表者らは正電荷コレステロール誘導体を素材とした安全性の高い非ウイルスベクター(正電荷リポソーム)の開発に取り組んできた。代表者らの新規ベクターは高い安全性はもちろんのこと、遺伝子導入効率においても既存の非ウイルスベクターを大きく凌駕した。その上、正電荷リポソームにバイオ・サーファクタントを含有させると遺伝子導入効率が飛躍的に増大することを発見した。そこで、このバイオ・サーファクタント含有リポソームの遺伝子治療に応用するための基礎データの蓄積、遺伝子導入機構の解明、ならびに、動物を用いた遺伝子治療の実験を行った。その結果、(1)バイオ・サーファクタントの分子構造(分子種)により遺伝子導入の効率が大きく増大することを発見した。(2)中でも、バイオ・サーファクタントMEL-Aが最も高い遺伝子導入効率を与えた。(3)共焦点レーザ顕微鏡を用いた実験から、MEL-Aはカプセル化した正電荷リポソーム・DNA複合体の細胞膜への吸着、細胞内への取り込み過程を顕著に促進した。(4)バイオ・サーファクタントを用いた正電荷リポソームは遺伝子治療の新規非ウイルスベクターとして大変有用であると考えられた。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2002 -2003 
    Author : HIRASHIMA Naohide
     
    In this study, we investigated the role of membrane components other than membrane protein such as phospholipids and cholesterol in exocytotic release. 1.The role of transbilayer asymmetric distribution of phospholipids in exocytosis In order to disrupt the transbilayer asymmetry of phospholipids, lipid scramblase, which catalyze hi-directional movement of phospholipids between two membrane layers, was expressed in mast cells or PC12 cells. We found that exocytosis was significantly inhibited in these cells. This result suggests that transbilayer asymmetry of phospholipids plays an important role in exocytotic release. 2.The role of cholesterol in the plasma membrane in exocytotic process The effects of cholesterol depletion from the plasma membrane with methyl-β-cyclodextrin (MβCD) on exocytotic processes were investigated in mast cells. Pretreatment with MβCD inhibited antigen-evoked exocytosis. The inhibition of exocytosis by MβCD was observed even under stimulation with phorbol ester and calcium ionophore. Therefore, MβCD affected membrane fusion between granule and the plasma membrane. Intracellular Ca^<2+> measurements revealed that MβCD inhibited Ca^<2+> influx from the extracellular medium through the store-operated calcium channel (SOC) without affecting Ca^<2+> from Ca^<2+> store. These results suggest that cholesterol depletion inhibits degranulation mainly by impairing SOC and exocytotic membrane fusion between granules and the plasma membrane. 3.Raft protein flotillin regulates IgE receptor mediated signaling We investigated the role of flotillin, which is localized in lipid rafts, in the early exocytotic process. We obtained flotillin-1 knockdown RBL-2H3 cells. In these cells, we observed a significant decrease in Ca^<2+> tyrosine phosphorylation of IgE-R, and exocytosis. We also found that flotillin is associated with Lyn in lipid rafts. Antigen stimulation causes augmentation of flotillin binding to Lyn, resulting in increased activity of Lyn. These results suggest that flotillin-1 is an essential molecule in IgE-R mediated activation, regulating the kinase activity of Lyn.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 2000 -2002 
    Author : NAKANISHI Mamoru; FURUNO Tadahide; HIRASHIMA Naohide
     
    The mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade consists of MAP kinase (MAP; ERK2) and its activator, MAP kinase (MAPKK; MEK). However, the mechanisms for activation of ERK2 have not been defined yet in cells. Here, we used fluorescent-tagged ERK2 and MEK to examine the localization of ERK2 and MEK in living rat basophilic leukemia (RBL-2H3) cells. ERK2 was mainly in the cytoplasm in resting cells, but translocated into the nucleus after the ligation of IgE receptors. The import of ERK2 reached the maximum at 6-7 min, and then the imported ERK2 was exported from the nucleus. MEK mainly resided in the cytoplasm, and no significant MEK translocation was detected after ligation of IgE receptors. The data suggested that the sustained calcium increase was required for the optimal translocation of ERK2 into the nucleus in RBL cells. However, analysis of the dynamics of ERK2 and MEK suggested that both of them rapidly shuttle between the cytoplasm and the nucleus, and that MEK regulate the nuclear shuttling of ERK2 while MEK remain mainly in the cytoplasm. Pretreatment of RBL-2H3 cells with cytochalasin D and Latrunculin A, inhibitors of actin polymerization, prolonged the nuclear translocation of ERK2 after antigen stimulation. Western blotting analysis revealed that these drugs enhanced the phosphorylation of both ERK2 and MEK after antigen stimuation. To the contrary, nocodazole, an inhibitor of tubulin polymerization, caused neither prolongation of nuclear translocation of ERK2 nor enhancement of phosphorylation of ERK2 and MEK. Dissociation of cross-linked receptors by the addition of excess amount of monovalent hapten halted translocation of ERK2 even in cells pretreated with cytochalasin D. Taken together, these results indicate that actin polymerization affects the nuclear shuttling of ERK2 by the regulation of IgE receptor cross-linking. These results gave a new insight of the dynamics of ERK2 and MEK in the nuclear shuttling of RBL-2H3 cells after Ag stimulation.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 2000 -2002 
    Author : NAKANISHI Mamoru; HANDA Tetsuro; HIRASHIMA Naohide; OHWADA Tomohiko; TOKUYAMA Satoru; OKU Naoto
     
    We will demonstrate interesting cationic liposomes with novel cationic cholesterol derivatives, a new strategy in gene transfection developed by our group and the presently accepted molecular mechanism of gene transfection. Use of confocal laser scanning microscopy and atomic force microscopy in elucidating the molecular mechanism of gene transfection by cationic liposomes is also showed using examples from our own work. As delineated, both the confocal laser scanning microscopic and the atomic force microscopic results advocate for the involvement of the sequential three steps in gene transfection mediated by the cationic liposomes: endocytotic internalization of the lipoplexes into the target cells, endosome-lysosome fusion whereby the DNA gets released from the liposomes and moves towards the nucleus of the target cells and microtubule organization apparently involved in trafficking the transfected foreign genes to lysosomes. Furthermore, our experiment also shows couple of important strategies in gene transfection namely, use of liposomes made from biosurfactans and harnessing efficient gene transfection by activating the membrane-bound receptor molecules.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 萌芽的研究
    Date (from‐to) : 2000 -2001 
    Author : 中西 守; 古野 忠秀; 平嶋 尚英
     
    リンパ球やマスト細胞の細胞膜には神経成長因子や神経ペプチドの受容体が存在し、免疫系と神経系の相互作用(クロストーク)が強く示唆されている。しかし、免疫系と神経系のクロストークを追求する適切な研究手段はほとんどなく、その分子機構の解明はこれまでほとんどなされてこなかった。そこで、神経細胞と免疫細胞(マスト細胞やT細胞)との共存培養のシステムを確立するとともに、それを用いて両者の細胞間相互作用を顕微技術、特に、原子間力顕微鏡を駆使して追及した。具体的には、(1)神経節初代培養細胞と免疫細胞(マスト細胞、T細胞)との共存培養システムの確立。(2)原子間力顕微鏡による神経節初代培養細胞と免疫細胞の相互作用解析の2項目に焦点を絞り研究を推進した。まず、新生胎児マウス神経節初代培養細胞と好塩基球細胞(RBL細胞)、マスト細胞、ならびに、T細胞との共存培養システムの確立に成功した。そして、神経ペプチドのサブスタンスPを介して、神経細胞からマスト細胞への活性化のシグナルが伝達される事を初めて明らかにした。次いで、原子間力顕微鏡による神経細胞とマスト細胞の相互作用の実態をナノメートルレベルで可視化解析した。神経成長因子の存在下で神経突起を伸長させた神経節初代培養細胞は、培養細胞RBLとシナップス様の構造体を形成し密着に接着し、RBL細胞を活性化していると推察された。神経突起の先端の成長円錐はRBL細胞の偽足と密着な細胞間相互作用を行っている事なども判明した。また、CD63-GFPキメラ蛋白質を利用した蛍光顕微鏡による研究成果ともよく対応していた。これらの結果は、神経免疫相互作用の細胞分子機構の解明に重要な貢献をなすものと判断された。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
    Date (from‐to) : 2000 -2001 
    Author : HIRASHIMA Haohide
     
    Allergic responses are triggered by the exocytotic release of inflammatory mediators such as histamine from mast cells. Although calcium influx from extra-cellular medium is indispensable responsible for this influx is still unknown. Recently, we found that TRP (transient receptor potential) channel, which is activated b the depletion of calcium store, is expressed in mast cells. Thus, we investigated the role of TRP and its activation mechanism in this study. 1. Intracellular Ca dynamics in RBL-2H3 cells with low activity of TRP. To examine the role of TRP in RBL-2H3 cells, we prepared two types of cells in which the activity of TRP is very low. One is the knock-down cell line in which the expression level of TRP1 is suppressed b anti-sense technique. The other is the dominant negative cell line in which the function of TRP1 is suppressed by the expression of truncated TRP1. In both cell lines, no significant difference on the calcium dynamics was observed. Therefore, it is suggested that TRP1 is not involved in the calcium influx, although TRP1 s expressed in mast cells. 2. The effects of hapten on the intracellular Ca dynamics. Mast cells are activated by the cross-linking of IgE receptors by multi-valent antigen, and intracellular calcium increase. It is known that addition of mono-valent hapten causes dissociation of IgE receptors and decrease in calcium concentration. To investigate the activation mechanism of calciium influx, we examined the effects of hapten on thapsigargin-induced calcium increase. Hapten did not decrease the calcium increase evoked by thapsigargin. These data suggest that the activation mechanism of calcium channel is different between antigen and thapsigargin stimulation, although both stimulation deplete calcium store.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 奨励研究(A)
    Date (from‐to) : 1998 -1999 
    Author : 平嶋 尚英
     
    平成11年度は計画書に基づいて次の2項目について研究を行なった。 (1)ラット好塩基球株(RBL細胞)の形質膜Caチャネル欠損ミュータント株の解析 (1)Ca濃度変化バターンの野生株との比較 形質膜のCaチャネルブロッカーであるランタンイオンとSK&F96365のCa濃度変化パターンに及ぼす影響を調べた。その結果、ミュータントで見られる一過性のCa濃度上昇は、形質膜Caチャネルの阻害によるパターンとほぼ同じであることが明らかとなった。 (2)膜蛋白質の電気泳動パターンの野生株との比較 形質膜を単離し、その電気泳動像をミュータントと野生株で比較したが、両者に特に差は認められなかった。このことから、昨年の研究によって得られたCaチャネル欠損ミュータントは、Caチャネルが存在しないのではなく、アミノ酸配列のわずかな変異にり機能が低下しているものと考えられる。 (2)ラット好塩基球株(RBL細胞)におけるTRPチャネルの発現と機能 上記(1)の研究によって、ミュータントからCaチャネルを同定することが困難となったので、TRPとよばれる肥満細胞のCaチャネルとと似た特徴をもつTRP(transient receptor potential)のホモログRBL細胞に発現しているかどうかを調べた。 (1)RT-PCRを行なうことによって、RBL細胞にTRPのホモログのうち、TRP1、2、6の3種類が発現していることが明らかとなった。 (2)最も発現量が多いと思われるTRP1をRBL細胞に過剰発現させ、その細胞のCa動態及び脱顆粒反応を調べた。その結果、抗原刺激によって引き起こされる細胞内Ca濃度上昇において、特にその持続相の延長が認められた。また、エクソサイトーシスによって細胞外に放出されるβ-ヘキソサミニダーゼの定量により、脱顆粒も増強されることが明らかとなった。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 基盤研究(A)
    Date (from‐to) : 1995 -1997 
    Author : 桐野 豊; 浜岡 勤; 平嶋 尚英; 川原 茂敬
     
    1.システムの改良:これまで、平面脂質二重膜に結合した膜電位感受性色素の蛍光をシングルホトダイオードカメラで測定していたが、これをノイズが小さく、受講面が大きくて高感度な冷却CCDカメラ(アストロカム社、KAF1400)に換えたところ、明確に、蛍光強度の膜電位依存性が測定できるようになった。従来より、神経節等の膜電位測定に経験的によく用いられてきた色素であるDi-4-ANEPPSは、膜電位に対する蛍光強度変化が大きいものであることが確認できた。 2.生体膜への応用:感覚器(嗅覚器としての大小触覚、あるいは、味覚器としての唇)を付けて切り出したナメクジの脳を膜電位感受性蛍光色素Di-4-ANEPPSで染色し、膜電位の時間的空間的パターンの変化を高速差分増幅式カメラ(富士写真フィルム、Deltaron 1700)により測定した。大触角に匂いを与えると、匂いの種類によらず、脳神経節前脳部の膜電位振動の周波数が増大した。小触覚に匂いを与えると、ナメクジが好む食物の匂いの場合には振動数が増大し、ナメクジが忌避する物質の匂いの場合には振動数が減少した。また、ナメクジが忌避する味物質を唇に適用したときには、前脳の膜電位が強く過分極方向にシフトした。更に、小触角に嗅覚-味覚連合学習により忌避性となった食物の匂いを与えた後の数秒間、特異的な興奮性を示す一群の細胞が存在することが見出された。このように、本研究で開発された膜電位感受性蛍光色素を用いる膜電位の光学的測定法は、脳における味覚・嗅覚情報処理機構や学習・記憶の機構に極めて有用な実験手法となることを示すことが出来た。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 1996 -1996 
    Author : KIRINO Yutaka; HIRASHIMA Naohide; SUZUKI Toshiharu
     
    (1)There exist N-, P/Q- and L-type voltage-dependent Ca channels (VDCCs) in the presynaptic plasma membranes of nerve terminals of the electric organ isolated from the Japanese electric ray Narke japonica. The acetylcholine (ACh) release was predominantly mediated by-and P/Q-type VDCCs. (2)cDNA for synaphine was cloned from the cDNA library prepared from the electric lobe of the ray. Synaphine was found to be associated with syntaxin, VAMP and SNAP-25, suggesting its involvement in the exocytosis. (3)cDNA for the Alzheimer's beta-amyolid presursor protein (APP) was also isolated from the above cDNA library. The analysis indicated the product protein, APP,was phosphorylated after its maturation. (4)There exist adenosine A_1 and A_<2B> receptors in the electric organ synaptic membrane. Activation of the latter increses the ACh release via potentiation of P/Q-type VDCCs while the activation of the former reduces the ACh release via inhibition of N-type VDCCs. (5)Antibodies from the lambert-Eaton syndrome (LES) patients reduced the ACh release by its specific down-regulation of P/Q-type VDCCs. (6)Immunization of rats or mice with the electric organ synaptosomes produced an animal model of LES.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1993 -1993 
    Author : 平嶋 尚秀
     
    1.エクソサイトーシスにおいて重要な役割を果たしている細胞内のCa濃度を細胞質領域と核領域に分けて測定した。1個の細胞内Ca濃度の測定は、Ca濃度感受性蛍光色素Fluo-3を用い、画像処理装置付きの蛍光顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡を使って観察した。 (1)細胞内Ca濃度の振動:0.1mug/mlのcompound48/80で刺激したラット腹腔肥満細胞の細胞質と核質の両方でCa濃度の振動が観察された。 (2)細胞内Ca濃度の一過性の上昇:1mug/mlのcompound48/80では、Ca濃度振動は観察されず、一過性のCa濃度上昇のみが観察された。このことは細胞質と核質の両方で観察されたが、核質のCa濃度の方が細胞質より高くなった。 2.エクソサイトーシスと細胞内Ca濃度の上昇をそれぞれキナクリンとCa感受性蛍光色素を用いて同時に測定した。 (1)細胞内Ca濃度振動とエクソサイトーシスの関係:細胞内Ca濃度振動は見られたがエクソサイトーシスに伴うキナクリンの蛍光の減少は見られなかった。従って、Ca濃度振動とエクソサイトーシスには相関がないことがわかった。 (2)細胞内Ca濃度の一過性の上昇:一過性のCa濃度上昇の後にエクソサイトーシスによるキナクリンの蛍光の減少が観察された。Ca濃度の上昇以前にエクサイトーシスがおこることはなかった。 3.エクサイトーシスに対する外液Ca濃度の影響 細胞外のCaをEOTAでキレートして、細胞外のfree Ca濃度を低くしても細胞内の一過性Ca濃度上昇はおこり、かつエクソサイトーシスも観察された。 以上のことより、エクソサイトーシスは細胞内Ca濃度振動とは関係なく、一過性のCa濃度上昇と相関がること。そしてその一過性のCa濃度上昇は細胞内のCaストアからのCaだけでもおこり、かつエクソサイトーシスを惹起するに十分であることが明かとなった。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 1992 -1993 
    Author : KIRINO Yutaka
     
    1. Action and binding of various Ca channel blockers were examined on the calcium channels triggering the release of acetylcholine (ACh) in the synaptosomes prepared form the electric organ of Japanese electric ray, Narke japonica. The data obtained suggests that the Ca channels subserving the ACh release are mainly of N- and P-types and the L-type also has a small contribution. 2. A monoclonal antibody, MCC-1, that recognizes the alpha _2 delta subunit of rabbit skeletal muscle, inhibited partially the ACh release. 3. Immunoaffinity chromatography using MCC-1 was employed to solubilized plasma membrane of the synaptosomes in order to purify proteins with affinity to MCC-1. The SDS-PAGE analysis and Western blotting of the purified fraction identified a 170 kDa polypeptide as an MCC-1 binding protein. 4. The purified fraction also contained syntaxin, which is known to be an essential protein for the membrane fusion. 5. Incorporation of the synaptosomes into a planar lipid membrane revealed the presence of a K channel but failed to show the presence of Ca channels. 6. A novel radioactive probes were developed to measure phospholipid translocation across the biomembranes. With this probe, it was found that synaptosomal plasma membrane contains a phoshatidylserine-specific translocase. On the other hand, no specific translocase was found in synaptic vesicles. 7. A simultaneous measurement of the degranulation and intracellular Ca change in rat peritoneal mast cells implicated that intracellular Ca rise is a prerequisite for degranulation. 8. Membranes of the secretory granules of mast cells contain a cation-channel which may be responsible for the formation of so-called fusion pore.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 奨励研究(A)
    Date (from‐to) : 1992 -1992 
    Author : 平嶋 尚英
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 奨励研究(A)
    Date (from‐to) : 1991 -1991 
    Author : 平嶋 尚英
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 1989 -1991 
    Author : KIRINO Yutaka; HIRASHIMA Naohide; ANZAI Kazunori
     
    Preparation method for sarcolemmal membrane vesicles from porcine cardiac myocytes in high purity was established. In order to evaluate the purity of the sarcolemmal membranes, it is useful to measure marker enzyme activity such as Na^+, K^+-ATPase activity as a whole by unmasking the latent activities. For the unmasking reagent, saponin was found to be very effective and convenient. Dihydropyridine receptor complex was purified in about 2000-fold by the use of immune affinity chromatography with a gel attaching a monoclonal antibody against alpha_2delta subunit complex of L-PM Ca^<2+> channel from rabbit skeletal muscles. alpha_1, alpha_2, and delta subunit were detected in SDS-PAGE analysis, while other subunit such as beta and gamma were not detected. The procedure established in this research takes shorter time than the procedures reported before. It may thus make us possible to reconstitute the purified subunit into proteoliposomes or planar bilayer membranes with keeping their activities in natural. The sarcolemmal vesicles were fused to planar lipid bilayers and ion channel activities were measured. In the solution containing 100 mM Ba^<2+>, lion-inactivating channels were detected at negative membrane potentials. One of the channel was identified as B-QW Ca^<2+> channel, which had been reported in the patch clamp experiment. In the solution containing 600 mM Na^+, a cation channel with a conductance of 10 pS between -80 to 0 mV was detected. The charmer also allows K^+ to pass through, and the permeability ratio between Na^+ and K^+ was unity. The channel therefore is a new non-selective cation channel, which has not been reported before.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業 奨励研究(A)
    Date (from‐to) : 1988 -1988 
    Author : 平嶋 尚英
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
    Date (from‐to) : 1987 -1988 
    Author : KIRINO Yutaka; HIRASHIMA Naohide; ANZAI Kazunori
     
    1. This study has two main objectives. One is the detection and characterization of ion channels of synaptosomal membranes and synaptic vesicle membranes. For this purpose, we adopted reconstitution of biomembranes into planar lipid bilayer or into giant proteoliposomes. The second objective is the development of a new experimental system, which allow us to apply various techniques not applicable, so far, to the reconstitution system. For this purpose, we attempted to prepare giant biomembrane vesicles, by fusion of biomembrane vesicles without use of exo-genous phospholipids. 2. We developed a simple method to obtain preparations of synaptosomes and synaptic vesicles from rat brain, which are minimal of contamina-tions by other membrane fractions. 3. A rapid and simple method to prepare giant proteoliposomes without use of detergent has been established. This technique has some advantages over conventional methods involving the solubilization/dialysis procedure. Using this newly developed technique as well as the planar membrane technique, we have detected several kinds of cation and anion channels. Synaptosomal membrane contains voltage-independent potassium channels, which may contribute to the determination of resting potential. A calcium-dependent potassium channel was also observed. Two kinds of mono-valent cation channels and an anion channel were found to occur in the membrane of synaptic vesicles. These channels may play an important role in the exocytosis of neurotransmitters from presynaptic terminals. 4. Using the treatment with a fusogenic compound such as polyethyleneglycol, electrofusion, partial digestion with proteases and/or freez-ing-thawing technique, we were able to prepare giant synaptosomes, 10-20 micrometers in diameter, without addition of exogenous lipid. Attempts to apply various procedures of electrophysiology and cell manipulation to these giant synaptosomes were made. Some of them had been so far impossible with reconstitute proteoliposomes. Insertion of a microelectrode and injection were carried out successfully. These results suggest that giant synaptosome should be a very useful system for the study of presynaptic functions and their mechanisms.

Social Contribution

  • 日本薬学会 代議員
    Date (from-to) : 2015/02/01-2017/01/31
    Role : Organizing member
    Category : Others
    Sponser, Organizer, Publisher  : 日本薬学会
  • 愛知県薬事審議会委員
    Date (from-to) : 2014-2016
    Role : Others
    Category : Others
    Sponser, Organizer, Publisher  : 愛知県
  • 科学研究費委員会専門委員
    Date (from-to) : 2012/12/01-2013/11/30
    Role : Others
    Category : Others
    Sponser, Organizer, Publisher  : 行政
    名古屋市立大学 科研費の第1段審査（書面審査）
  • 国家試験問題検討委員会「物理・化学・生物」部会委員
    Date (from-to) : 2012/04-2013/03
    Role : Others
    Category : Others
    Sponser, Organizer, Publisher  : その他
    名古屋市立大学 社団法人日本私立薬科大学協会主催の薬剤師の国家試験問題を検討する委員会委員として、薬剤師国家試験の「物理・化学・生物」についてコメントする。
  • 日本学術振興会 特別研究員等審査会専門委員
    Date (from-to) : 2012/09-2012/10
    Role : Others
    Category : Others
    Sponser, Organizer, Publisher  : 行政
    名古屋市立大学 特別研究員等の審査
  • 静岡県立大学教員採用等資格審査委員
    Date (from-to) : 2012/08-2012/10
    Role : Others
    Category : Others
    Sponser, Organizer, Publisher  : 静岡県立大学
    名古屋市立大学 静岡県立大学薬学部の教員採用に係る資格審査

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