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Advance

HOSHINO Shinichi

    Graduate School of Pharmaceutical Sciences Department of Biological Chemistry　Professor
Contact： hoshinophar.nagoya-cu.ac.jp
Last Updated :2024/04/26

Researcher Information

URL

Research funding number

  • 40219168

J-Global ID

Research Interests

  • mRNA therapeutics   post transcriptional regulation of gene expression   mRNA decay   

Research Areas

  • Life sciences / Cell biology
  • Life sciences / Pharmaceuticals - health and biochemistry
  • Life sciences / Molecular biology

Association Memberships

  • THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN   THE JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY   THE RNA SOCIETY OF JAPAN   THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN   

Published Papers

MISC

  • 夢の新薬mRNA医薬
    星野 真一  名市大ブックス  14-  24  -31  2023/06  [Invited]
  • mRNAの分解機構に基づいたmRNA医薬の安定化
    星野真一  現代化学特集号『台頭するmRNA医薬』  620-  38  -40  2022  [Invited]
  • がん抑制遺伝子産物TobによるmRNA分解を介したがん抑制と学習記憶の調節
    尾上耕一; 星野真一  ファルマシア特集号『RNA研究が切り開く薬学フロンティア』  51-  (1)  27  -31  2015  [Invited]
  • mRNA分解研究と創薬
    尾上耕一; 星野真一  日本薬理学雑誌  136-  150  -154  2010  [Invited]
  • Shin-ichi Hoshino  Tanpakushitsu kakusan koso. Protein, nucleic acid, enzyme  54-  (16 Suppl)  2066  -2072  2009/12  [Invited]
  • 培養細胞からのRNA抽出
    星野真一; 細田直  RNA実験ノート  39  -41  2008  [Invited]
  • RT-PCRを用いたRNAの検出と定量
    星野真一; 船越祐二  RNA実験ノート  66  -69  2008  [Invited]
  • 真核生物におけるmRNA分解制御の分子機構
    船越佑司; 星野 真一  実験医学  23-  1902  -1907  2005
  • 打田 直行; 星野 真一; 堅田 利明; Ann-Bin Shyu  蛋白質核酸酵素  48-  (11)  1488  -1495  2003/08
  • 真核生物mRNAの分解制御
    星野 真一  蛋白質 核酸 酵素  48-  1229  -1240  2003
  • 打田直行; 星野真一; 堅田利明  生化学  74-  (8)  1009  2002/08
  • 星野真一; 細田直; 小林哲夫; 打田直行; 堅田利明  生化学  74-  (8)  699  2002/08
  • GSPTファミリーによる遺伝子発現調節
    星野 真一  生化学  74-  1343  -1348  2002
  • 真核細胞のmRNA動態を制御する新規Ｇタンパク質ファミリー
    荒木保弘; 星野真一; 堅田利明  実験医学  20-  150  -157  2002
  • T Katada; Y Araki; N Hosoda; T Kobayashi; N Uchida; S Hoshino  JAPANESE JOURNAL OF PHARMACOLOGY  88-  48P  -48P  2002
  • 打田直行; 星野真一; 堅田利明  生化学  73-  (8)  859  2001/08
  • 鈴木 崇弘; 岡田 太郎; 星野 真一; 櫨木 修; 宇井 理生; 堅田 利明  日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集  19-  151  -151  1996/08
  • 堅田 利明; 紺谷 圏二; 柊元 巌; 岡田 太郎; 黒須 洋; 井上 晋一; 辻本 典子; 星野 真一; 植木 修  日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集  19-  31  -31  1996/08
  • 岸本 宏之; 星野 真一; 堅田 利明  日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集  19-  437  -437  1996/08
  • 星野 真一; 堅田 利明  日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集  19-  326  -326  1996/08
  • 前濱 朝彦; 星野 真一; 堅田 利明  日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集  19-  474  -474  1996/08
  • 辻本 典子; 紺谷 圏二; 岡田 太郎; 星野 真一; 櫨木 修; 堅田 利明  日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集  19-  615  -615  1996/08
  • ３量体Ｇ蛋白質の立体構造と機能領域
    星野真一; 堅田利明  細胞内情報伝達のしくみ （宇井理生 編）（羊土社）  40  -59  1996
  • ３量体Ｇ蛋白質
    井上晋一; 柊元 巌; 星野真一; 堅田利明  シグナル伝達実験法 （宇井理生 編）羊土社  98  -107  1996
  • ヒトリンパ球表面抗原CD38の酵素活性とCD38を介する細胞内蛋白質のチロシンリン酸化
    紺谷圏二; 星野真一; 柊元 巌; 井上晋一; 櫨木 修; 高橋勝宣; 堅田利明  実験医学  14-  420  -423  1996
  • 三量体G蛋白質の構造、機能ドメイン
    星野真一  広川ニューロサイエンス5 情報変換物質ーG蛋白質（広川書店）  1  -18  1995
  • 三量体Ｇ蛋白質のターゲットと認識部位
    星野真一; 堅田利明  実験医学  13-  657  -666  1995
  • シグナル伝達系におけるNAD+代謝酵素とサイクリックADPリボース
    堅田利明; 紺谷圏二; 柊元 巌; 井上晋一; 星野真一; 櫨木 修; 高橋勝宣; 仁科博史  日薬理誌  45P  -49P  1995
  • シグナル伝達系に登場した新しいNAD+代謝酵素
    堅田利明; 仁科博史; 高橋勝宣; 星野真一; 紺谷圏二; 前濱朝彦; 柊元 巌  蛋白質 核酸 酵素  40-  1900  -1911  1995
  • 細胞の外側のシグナルを内側に運ぶＧ蛋白質−最近の進歩−
    堅田利明; 星野真一  呼吸  14-  1045  -1051  1995
  • 三量体Ｇタンパク質の構造と基本的特性
    星野真一; 堅田利明  日薬理誌  1032-  249  -262  1994
  • S. Hoshino; T. Katada  Folia Pharmacologica Japonica  103-  (6)  249  -262  1994
  • 細胞増殖を制御する情報伝達系ーG蛋白質を介する情報伝達系を中心としてー
    星野真一; 宇井理生  病態生理  11-  733  -739  1992
  • 細胞膜受容体、G蛋白質による情報伝達
    星野真一  MARUZEN ADVANCED TECHNOLOGY SERIES 生体膜工学（丸善）  223  -252  1991
  • 受容体とGTP結合蛋白質
    星野真一; 宇井理生  神経研究の進歩（医学書院）  34-  903  -909  1990
  • GTP結合蛋白質と情報伝達
    星野真一  臨床検査（医学書院）  33-  1668  -1669  1989
  • GTP結合蛋白質と情報伝達
    星野真一; 宇井理生  神経研究の進歩（医学書院）  33-  919  -929  1989
  • GTP結合蛋白質（G蛋白質）
    星野真一; 宇井理生  医学のあゆみ（医歯薬出版）  147-  729  -731  1988
  • Katada Toshiaki; Kurose Hitoshi; Oinuma Masayuki; Hoshino Shin-ichi; Shinoda Masahiko; Amanuma Shuichi; Ui Michio  Gunma symposia on endocrinology  23-  45  -67  1986

Industrial Property Rights

  • 特許7032775:人工合成mRNAの発現を効率化する技術  
    星野 真一, 細田直, 野木森拓人
  • 特許PCT/JP2020/ 39160:Artificially synthesized mRNA and use of same  
    星野真一, 細田直  Nagoya City University
  • 特願2014-107562:人工合成mRNAの翻訳効率化方法  2014年/05/23
    星野 真一, 細田直, 野木森拓人
  • 特願2014-263857:人工合成mRNAの安定化方法  2014年/05/09
    星野 真一, 細田直, 野木森拓人

Research Grants & Projects

  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2021/04 -2025/03 
    Author : 星野 真一; 稲垣 佑都; 細田 直
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2017/04 -2021/03 
    Author : Hoshino Shinichi
     
    Messenger RNA (mRNA) carrying “genetic information” has 3’ poly(A) tail whose length regulation plays central roles in the post-transcriptional control of gene expression. Thus far, we have elucidated the mechanism of mRNA deadenylation (the initiation of mRNA decay), as well as negative regulation of gene expression targeting the deadenylation step. In this study, we have demonstrated that the positive regulation of gene expression by the post-transcriptional polyadenylation widely exists in somatic cells, and succeeded in verifying its general mechanism.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2017/06 -2019/03 
    Author : Hoshino Shin-ichi
     
    Much attention has been focused on the mRNA-based therapeutics as an alternative to the DNA-based therapeutics, since mRNA can be used for generation of induced pluripotent stem (iPS) cells, cancer therapy etc. without the risk of transgene insertion into genomes. However, it remains a critical issue that mRNA is unstable and transient in cells. Here, we developed a method stabilizing synthetic mRNA in cells and found our methodology to be useful especially for genome editing in cells.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2013/04 -2017/03 
    Author : Hoshino Shin-ichi
     
    The mRNA 3’ poly(A) tail length regulation plays central roles in the post-transcriptional control of gene expression. In this study, we aimed to verify novel regulatory mechanisms of gene expression targeting mRNA poly(A) tail and unraveled the whole picture of the following mechanisms: (i) negative regulation of gene expression by the shortening of the poly(A) tail of mRNA (e.g., c-myc and GluR2), (ii) positive regulation of gene expression by the lengthening of the poly(A) tail of mRNA (e.g., p27kip1, hnRNPA1 and b-catenin), and (iii) stress-induced global regulation of gene expression by the stabilization of mRNA poly(A) tail and formation of stress granules.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2008/11 -2014/03 
    Author : INADA Toshifumi; INOUE Kunio; NAKAMURA Akira; OHNO Mutsuhito; HIROSE Tetsuro; HOSHINO Shinichi; YONEYAMA Mitsutoshi; SUGIURA Reiko
     
    生物の持つ複雑で巧妙な形態・機能の獲得には、RNA段階での遺伝子発現制御プログラムが極めて重要な役割を果たします。発生・分化の基本原理としての「非対称性」と遺伝子産物の「多様性」の獲得原理を理解するためには、RNAレベルでの制御（RNAプログラム）を包括的に理解する必要があります。本新学術領域研究「多様性と非対称性を獲得するRNAプログラム（RNA制御学）」は、このRNAプログラムの分子機構とその生理的意義の解明を目指しました。RNAレベルでの制御を研究する若手ならびに中堅の研究者を中心とした組織を構成し、手法、材料や情報を共有しながら交流を行い、研究を進めました。分子・細胞レベルから遺伝学を用いた高次生命現象解析まで、幅広いアプローチでRNA研究を展開し必要に応じて共同研究を積極的に進めました。平成２０－２４年度までの研究期間において、計画研究のみならず公募研究においても優れた研究成果を上げる事ができ、当初の目的を概ね達成できました。また、多数の若手ならびに中堅研究者がプロモーションされました。領域内の連携を促進する支援班活動等を行った結果、共著論文も発表することが出来ました。平成２５年度は、理化学研究所や関連する新学術領域研究「非コードRNA」とRNA Sciences in Cell and Developmental Biology III共催した、内外のRNA研究者から高い評価をうけ、本領域における優れた研究を国内外に宣伝する非常に良い機会となりました。また、研究成果報告書を作成し、班員と評価者の先生方、関連分野の研究者に配布しました。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2011 -2012 
    Author : HOSHINO Shinichi
     
    In the present study, we have constructed a yeast strain expressing chimeric prion protein in which prion domain of the yeast eRF3 (Sup35) was replaced by that of human PrP. Most of the modified yeast cells spontaneously transformed to [PSI^+] and the [PSI^+] transformants were returned to [psi^-] when the cells were treated with guanidine hydrochrolide. The eRF3-PrP prion had no effect on the growth of yeast cells. Thus, we confirmed that the modified [PSI^+] prion, the amyloidgenic isoform of eRF3-PrP, could be an ideal model for investigating prion disease in yeast and for screening therapeutic drugs against prion.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2010 -2012 
    Author : INADA Toshifumi; HOSHINO Shin-ichi
     
    The receptor for activated C kinase (RACK1) was identified as a factor required for nascent peptide-dependent translation arrest, and the binding of RACK1 to 40S subunit is crucial for translation repression by poly-basic amino acid sequence. Two E3 ubiquitin ligases, Ltn1 and Not4, are involved in proteasomal protein degradation coupled to translation arrest, and translation arrest by RACK1 is required for Ltn1-depepdnet protein degradation.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2009 -2012 
    Author : HOSHINO Shinichi; HOSHODA Nao
     
    We have previously demonstrated that mRNA decay is initiated in couple with translation termination, where eukaryotic releasing factor eRF3 plays central roles. Here we showed that mRNA quality control mechanism eliminating aberrant transcripts lacking stop codon exists in mammalian cells, where another eRF3 family G protein Hbs1 and exosome complex play essential roles.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2008 -2012 
    Author : HOSHINO Shinichi; HIROSE Teturou
     
    Based on mRNA deadenylation mechanism originally uncovered by us, we have newly identified the following mechanisms of the posttranscriptional gene regulation and RNA quality control. (i) deadenylation mediated by mRNA 3’ UTR cis elements (URE, CPE) and negative regulation of gene expression, (ii) stress-induced global stabilization of mRNA poly(A) tails and formation of stress granules, (iii) mRNA polyadenylation mediated by the non-canonical poly(A) polymerase and positive regulation of gene expression, (iv) quality control of aberrant nonstop mRNA. We also verified quality control mechanism of the nuclear histon mRNA.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2008 -2009 
    Author : 細田 直; 星野 真一
     
    翻訳終結反応過程では、tRNA類似構造をとることにより終止コドンを認識するeRF1およびG蛋白質eRF3の2種類の因子が関わる。eRF3はeRF1をリボソームAサイト上の終止コドンまで運搬する機能を担う。先に当研究室では、翻訳終結反応にともない、eRF3を介してmRNA分解の律速段階である3'末端poly(A)鎖短縮化が促進されることを明らかにした。G蛋白質eRF3は、翻訳終結反応のみならず、mRNA分解を制御する役割を担う。一方、近年mRNA品質管理において機能する分解経路が明らかにされた。ナンセンスコドン介在型mRNA分解(N onsense-mediated mRNA decay ; NMD)、終止コドンリードスルー型mRNA分解(Non-stop decay ; NSD)、リボソーム停止型mRNA分解(No-go decay ; NGD)であり、いずれもリボソームのmRNA上における一時停止が分解の引き金となる。eRF3を介したmRNA分解と類似の機構がはたらくと想定されるものの、これら経路については不明な点が多く残されている。本研究では、eRF3およびその類似G蛋白質eRFSに着目して、NSDの分子機構について解析を進めた。 終止コドンをmRNA上より全て除いたレポータを作製し、哺乳動物細胞におけるNSDについて解析を行ったところ、終止コドンを持たないmRNAの速やかな分解が確認された。また、poly(A)鎖短縮化については、終止コドンを持たないmRNAと正常なmRNAとの間において顕著な差は認められなかった。eRF3およびeRFSのNSDへの関与を、siRNAを用いたノックダウンにより検討した。eRFSのノックダウンによりNSDの抑制が認められた。eRF3ではこの抑制は認められなかった。mRNAの3'から5'方向への分解にはエキソソーム複合体がその役割を担う。eRFSとエキソソーム複合体の間において相互作用が観察された。一方、eRF3においてはこの相互作用は認められなかった。哺乳動物のNSDにおいては、3'末端においてストールしたリボソームにeRFSが導入されることが引き金となっており、またeRFSはエキソソーム複合体をmRNA3'末端に導入することで終止コドンを持たないmRNAを速やかに分解すると推察された。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2008 -2008 
    Author : 星野 真一; 細田 直
     
    翻訳終結因子eRF3/GSPT1のN末端にはGGCトリプレットリピートによってコードされるポリグリシンが存在し、健常人においてはこの繰り返しが10前後であるのに対し、12以上になると胃癌発症の危険率が20以上に増大する。また一方で、eRF3/GSPT1は各種ストレスによってN末端が特異的に切断され、その際露出したN末端配列がカスパーゼ阻害因子IAPと特異的に結合してカスパーゼを活性化し、アポトーシスを誘導する。従って、eRF3/GSPT1のN末端領域におけるトリプレットリピートの増大は、ストレスによるN末端の切断を阻害し、アポトーシスの誘導を阻害することにより胃癌の発症率増大を引き起こしている可能性が高い。本研究においては、このような仮説を含め、eRF3/GSPTのトリプレットリピート増幅が胃癌の発症率増大を引き起こす分子メカにズムを解明することを目的として解析を行なった。 (1)eRF3/GSPT1のトリプレットリピートアイソフォームの作製 グリシンをコードするGGCトリプレットリピートが、それぞれ0、5、10、12であるアイソフォームをPCR法を用いて作製し、細胞にトランスフェクトして細胞染色による細胞内局在性について検討した。各種アイソフォームはどれも細胞質において発現し、細胞内局在性における変化はとくにみられないことを確認した。 (2)トリプレットリピート多型性がeRF3/GSPT1による遺伝子発現制御におよぼす影響の検討 eRF3/GSPT1のトリプレットリピートアイソフォームをβグロビンのレポーター遺伝子とともにHeLa細胞に遺伝子導入をおこない、細胞内での過剰発現がβグロビンの遺伝子発現に与える影響について検討した。その結果、どのアイソフォームにおいてもβグロビンの発現量に変動は観察されなかった。 (3)トリプレットリピート多型性がストレスによるeRF3/GSPT1N末端領域の切断に及ぼす影響 eRF3/GSPT1のトリプレットリピートアイソフォームをHeLa細胞に遺伝子導入し、アミノ酸飢餓ストレスを加えた際に観察されるN末端の切断活性について検討を行なった。その結果、正常なリピートをもつGly11に対して胃癌発症率が増大するGly12の場合においてN末端の切断効率が低下することが観察された。 なお、本研究は新学術領域研究の採択に伴い廃止したため約8ヶ月間の研究期間で行なったものである。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2006 -2007 
    Author : 星野 真一
     
    真核生物の翻訳終結においては、終止コドンを直接認識する翻訳終結因子eRF1がリボソームA部位に入り込み、ペプチジルトランスフェラーゼを活性化することでペプチジルtRNAからペプチド鎖の解離を引き起こし翻訳が終結する。その際第二の翻訳終結因子eRF3はeRF1をリボソームに運搬する役割を担っている。一方、原核生物においては真核生物のeRF1/eRF3に相当する翻訳終結因子RF1,2/RF3が同様に翻訳終結反応を担っているが、翻訳終結後RF1,2と同様なtRNA用構造を有するリボソームリサイクリング因子がリボソームA部位に入り込み、翻訳終結後のリボソームをmRNAから解離させる役割を果たしている。環状構造を有する真核生物mRNAにおいてもそのようなリサイクリング因子が働く可能性が充分考えられ、真核生物リサイクリング因子の実態解明にむけて解析を行なった。本研究において申請者らは、(1)リサイクリング因子の候補として、翻訳終結因子eRF1と構造上高い相同性を有するeRFLをヒトにおいて同定し、(2)すでに報告されているeRF3相同因子eRFSと結合することを証明した。また、(3)両因子のポリソームプロファイル解析より、両者は共にポリソーム画分に局在することを証明した。(4)eRFLはeRF1と同様に単独でもリボソームに結合し、その結合はtRNAやeRF1の共存によりリボソームから解離することを見出した。従ってこれらの因子はeRF1/eRF3同様リボソームA部位において機能する因子である。一方で、(5)これらの因子のみでは、ポリソーム画分からリボソームを解離させる活性は検出できなかったことから、これらの因子と相互作用する第三の因子について探索を行ない、GAPDHを同定した。これらが3者複合体を形成しリサイクリングを制御する可能性についてHeLaのin vitro翻訳系を用いて検討中である。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2005 -2006 
    Author : HOSHINO Shinichi
     
    In this study, we have investigated the initiation mechanism of mRNA decay. Control of mRNA decay is a fundamentally important step in determining the amount of protein produced from the mRNA by translation, and mRNA decay is intimately linked to and regulated by translation. In eukaryotes, decay of most mRNAs is initiated by shortening of the poly(A)-tail at the 3' end, referred to as deadenylation. Deadenylation is the first and rate-limiting step and also the most efficient step in controlling mRNA decay. Two major deadenylase complexes, Caf1-Ccr4 and Pan2-Pan3, play central roles in this process. However, the molecular mechanism triggering deadenylation remained elusive. We previously showed that translation termination factor eRF3 interacts with poly(A) binding protein (PABPC1) through its N-domain and that eRF3 regulates the initiation of mRNA decay at the poly(A) tail shortening step through the interaction with PABPC1 in a manner coupled to translation termination. Thus, translation termination triggers mRNA decay. Here we examined the mechanism of mRNA deadenylation and obtained evidence fir a molecular interplay between translation termination factor eRF3 and mRNA deadenylases. We have demonstrated that eRF3-mediated deadenylation is catalyzed by both of the two major mRNA deadenylase complexes, Caf1-Ccr4 and Pan2-Pan3, in yeast and humans. Interestingly, translation termination complex eRF1-eRF3, Pan2-Pan3 and Caf1-Ccr4 competitively bind to the PABC domain of PABPC1. In each complex, eRF3, Pan3 and Tob, respectively, mediate PABPC1-binding. The PAM2 motifs found in both eRF3 and the two deadenylase complexes are responsible both for their binding to PABPC1 and for mRNA deadenylation. The termination complex and the deadenylase complex are exchanged on PABPC1 in a translation-dependent manner. Recruitment of the two deadenylase complexes to PABPC1 leads to the activation of both enzymes. From these results, we suggest a mechanism of mRNA deadenylation by Pan2-Pan3 and Caf1-Ccr4 in cooperation with eRF3 and PABPC1.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2004 -2005 
    Author : NISHINA Hiroshi; WADA Teiji
     
    Stress-activated protein kinase/c-Jun NH_2-terminal kinase (SAPK/JNK) is activated by many types of cellular stresses and extracellular signals. Recent studies, including the analysis with knockout mice, have led to progress towards understanding the physiological roles of SAPK/JNK activation in embryonic development in addition to immune responses. SAPK/JNK activation plays essential roles in organ formation during mouse development by regulating cell survival, apoptosis, and proliferation. Two SAPK/JNK activators, SEK1 and MKK7, are required for fetal liver formation and full activation of SAPK/JNK, which responds to various stimuli in an all-or-none manner. Thus, several genes that are crucial for liver formation and function have been isolated in mice and confirmed by reverse genetics. Although a reverse genetic approach is powerful in characterizing function of known genes, knowledge of genes in liver formation and disease is still limited. Therefore, identifying mutations affecting these aspects will uncover genes required for these processes. Systematic forward genetic screens for mutations affecting liver formation and function such as hepatic bud formation, liver morphogenesis, bile color in the gall bladder, lipid metabolism, and liver laterality have been carried out in Medaka, Oryzias latipes. To isolate mutants that model human liver diseases, we are analyzing these mutations. Among them, kendama (ken) mutation was isolated as a gene that affects the laterality of the liver. ken mutant was viable and fertile with inverted positions of liver and heart, and with inverted spiral of gut. Interestingly, the spleen was almost lost in ken mutant. This phenotype is very similar to human genetic disease 'asplenia' whose gene mutation is still unknown. Furthermore, white livers consisting of bloated and Oil red O-positive hepatocytes were observed in ken mutants. Thus, ken mutation models human disease asplenia and Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) or non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Especially, NAFLD and NASH are serious human diseases in the modern world, so ken mutation may shed a new light on the molecular mechanisms of these diseases and the preventive medicine.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2004 -2005 
    Author : 仁科 博史; 和田 悌司; 梶保 博昭; 堅田 利明; 星野 真一
     
    細胞膜から初期エンドソームに向けての輸送小胞によるエンドサイトーシス(ES)は、恒常的な細胞外物質の取り込みのほか、受容体の脱感作過程においても重要である。本研究では、新規のRab5-GEFであるRIN2、RIN3を中心に、Rab5の活性化機構の視点からESの制御機構を解明することを目的とした。Rab5結合蛋白質として同定したRIN2とRIN3は、H-Rasの相互作用因子として先に報告されたRIN1と一次構造上の相同性を有するが、このファミリーには酵母のRab5-GEFに相同なVps9ドメインが存在し、Rab5に対してGEF活性を有した。RIN2、RIN3はアンフィファイシンIIとも結合し、形質膜での小胞形成から初期エンドソームの融合までの経路に関与することが期待される。 RINファミリーには、SH2ドメイン、SH3ドメインが結合するProに富む配列、Rabのグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)として機能するVps9ドメイン、Rasメンバーとの結合が推定されるRAドメイン等の機能領域があり、小胞の出芽と輸送の初期過程において、これらの領域を介して種々のシグナルを集積する足場的役割を果たすことを見出した。現在これらファミリーを特異的に認識する抗体の作成が進行中である。また、新規G蛋白質ファミリーの網羅的な解析から、ESへの関与が期待される分子群Di-Ras、Rhebを同定した。特に、後期エンドソームからリソソーム小胞に局在化するRhebは、グリア細胞におけるグルタミン酸トランスポーターの形質膜と細胞内小胞間の移行を制御して、神経細胞の保護に寄与することを見出した。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2001 -2005 
    Author : KATADA Toshiaki; KONTANI Kenji; KAJIHO Hiroaki
     
    In eukaryotic protein synthesis, all three termination codons are directly recognized by a polypeptide-chain releasing factor, eRF1,to release polypeptide chain from ribosome, and another releasing factor, eRF3,is required for eRF1 binding to ribosomal A site. We previously reported that a GTP-binding protein, whose carboxy-terminal sequence is homologous to the eukaryotic elongation factor EF1α, forms a complex with eRF1 to function as eRF3 in the translation termination and that eRF3 consists of the EF1α-like carboxy-terminal (C) and amino-terminal (N) domains. In the present studies, we investigated the structures and functions of eRF3 and its related G proteins. The major findings obtained in this study are summarized as follows. 1)The C domain of eRF3 associated with eRF1,whereas the N domain was capable of binding to poly-adenylate binding protein (PABP) associating with the poly(A) tail of mRNAs presumably for their stabilization. 2)When the interaction between eRF3-N domain and PABP was abolished, decay rate of all mRNAs was decreased due to the inhibition of poly(A) tail shortening. 3)We identified a poly(A) nuclease (PAN) complex that is activated by PABP and found that eRF3 and PAN complex competitively bound to PABP. These results indicate that the translation termination-coupled mRNA decay is mediated through eRF3-dependent poly(A) shortening. Thus, eRF3 functions not only as an eRF1-carrier protein in the translation termination but also as an initiator of the mRNA degradation machinery. 4)We also investigated the functions of other G proteins (Ski7 and eRFS) structurally related to eRF3 and found that the N domains of these G proteins commonly interact with factors involved in mRNA-degradation machineries to regulate mRNA stabilization.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2004 -2004 
    Author : 仁科 博史; 堅田 利明; 星野 真一; 荒木 保弘
     
    先に申請者らは、ストレス応答性のMAPキナーゼシグナル伝達系であるJM(/SAPK系の生理的役割を明らかにする目的で、本シグナル系を正に制御する活性化因子SEK1/MKK4や、MKK7ノックアウトマウスを作出し、JNK系が肝芽細胞の増殖・生存など肝形成に必須の役割を果たしていることを明らかにした。また、これまでに神経変性疾患DRPLAの原因遺伝子の産物がJNKの基質となり活性制御を受けていること、また、好中球の活性酸素産生時にアダプター分子であるGab2がERKによってリン酸化され、リン脂質キナーゼであるPI3キナーゼの活性調節に関与することを見い出している。本年度は、SEK1やMKK7を欠損する胚性線維芽細胞の解析から、JNKがc-Junのリン酸化を介して細胞周期G2/M期促進や細胞老化抑制に関与することに加えて、細胞の状態に応じてJNK系のアポトーシス誘導能に変化が生じることを見い出した(Nat.Cell Biol.6,215-226,2004,J.Biol.Chem.279,1621-1626,2004,J.Biochem.[review]136,123-126,2004)。これらの成果は、JNKがc-Jun以外の標的の存在を強く示唆し、本研究目的の一つを達成したと考えられる。一方、放射標識された非天然型のATPアナログの合成とこれをリン酸化反応の基質として利用可能な点変異MAPキナーゼを作製することによって、変異MAPキナーゼだけが標的分子に放射標識されたγ位のリン酸基を転移できるような実験系では実用化に向けて、高非活性のATPアナログの合成や細胞膜を透過しにくい非天然型ATPアナログを細胞内に導入する条件が検討されている。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2004 -2004 
    Author : 仁科 博史; 堅田 利明; 星野 真一
     
    低分子量G蛋白質はRas, Rab, Rho/Rac, Arf, Ranといったサブファミリーに分類され、それらは細胞の分化や増殖に加えて、小胞輸送、接着・形態形成・核内輸送などの多彩な細胞機能を制御する。しかしながら、既存のサブファミリーには属さない機能未知の低分子量G蛋白質も数多く残されている。ゲノムプロジェクトの成果を活用してユニークな新規G蛋白質を単離・同定し、その機能を解析することは、新しいシグナル伝達系の解明、さらには低分子量G蛋白質の普遍性と多様性の理解に貢献すると考えられる。本研究では申請者が独自に同定した二つのアティピカルな新規低分子量G蛋白質GieとDi-Rasが介在するシグナル伝達系の解明を目的とした。 Gie (novel GTPase indispensable for equal segregation)は、一次構造上既知のG蛋白質とは異なるサブファミリーを形成する点でアティピカルである。不活性型を模倣する変異体を動物細胞に強制発現した結果、多数の微小核をもつ異常な分裂細胞像が観察され、さらにショウジョウバエ由来細胞でのRNAiによる発現抑制によって、染色体分離異常に典型的な表現型を認めた。一方のDi-Ras (Distinct subgroup of Ras-family GTPase)はRasと一次構造上の相同性を有するものの、細胞内で主にGTP型(活性化型)で存在して発現組織が神経・心臓に特異的な点でアティピカルであることを明らかにした(J Cell Sci.117:4705-4715,2004)。これら研究成果は、アティピカル低分子量G蛋白質が関与する新しいシグナル伝達の解明に多大な貢献をすると期待される。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2003 -2004 
    Author : 星野 真一; 堅田 利明; 仁科 博史; 荒木 保弘
     
    我々は翻訳終結因子であるeRF3/GSPTが、eRF1と相互作用し翻訳終結過程を制御する一方で、ポリA鎖結合蛋白質(PABP)とも相互作用し翻訳終結と共役してmRNA分解過程を制御していることを示してきた。本研究の目的は、この翻訳終結と共役したmRNA分解の分子機構の詳細を明らかにすることにある。平成16年度においては、特にeRF3/GSPTのGTP結合蛋白質(G蛋白質)としての性質に着目し、共役過程においてこのG蛋白質としての特性がどのように使われているかを検討し、以下の知見を得た。(1)eRF3/GSPTはGTP結合型においてeRF1と結合し、このようなGTPの効果は、他のヌクレオチド(ATP, UTP, CTP, ITP)では観察されない。また、GDP結合型においてeRF3/GSPTは、eRF1から解離する。eRF3/GSPTのGTP結合部位に変異を導入するとeRF1との結合が阻害されることからもこのGTP依存性の重要性が裏付けられた。また、このような変異をもつ細胞株を作製し翻訳終結過程を調べると異常が観察されることから、eRF3/GSPTへのGTPの結合が翻訳終結において必須の役割を果たしていることを証明することができた。(2)一方、eRF3/GSPTとPABPとの結合に関しては、GTP結合型、GDP結合型に関わらず観察され、eRF3/GSPTのGTP結合部位の変異による影響も観察されなかった。しかしながら、このような変異をもつ細胞株において、mRNA分解過程には異常が観察され、mRNA分解過程がGTP依存的な翻訳終結過程と共役しているということを強く示唆した。(3)さらに、eRF3/GSPTの機能欠損株においてeRF1を過剰発現すると翻訳終結は正常なレベルに回復するが、このような株においてmRNA分解の異常は回復しないことから、mRNA分解を引き起こすには翻訳終結にみでは不十分でありeRF3/GSPTが必須の役割を果たしているいることを証明した。以上のように、eRF3/GSPTはG蛋白質としての特性を使い、翻訳終結とmRNA分解とを共役させる分子スイッチとして機能していることを明らかにした。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2000 -2004 
    Author : KATADA Toshiaki; NISHINA Hiroshi; HOSHINO Shin-ichi
     
    G protein-coupled or tyrosine kinase-linked receptors are involved in the regulations of many signal transductions. After the stimulation of these membrane receptors, not only the receptor molecules themselves but also ion channels or transporters are internalized into the cells through endocytic pathways. Thus, there is vectorial transportation in the membrane trafficking. In this study, we investigated the molecular mechanisms whereby these receptors regulate the vectorial transportation. The major findings obtained in this study are summarized as follows. 1) The lipid kinase phosphatidylinositol (PI) 3-OH kinase is synergistically stimulated by different types of membrane receptors, such as G protein-coupled and tyrosine kinase-linked receptors. We have found that the class I (p110beta subtype) PI 3-OH kinase is responsible for the synergistic stimulation and that its adaptor, Gab2, is involved in the signaling through its dual phosphorylation by Src tyrosine kinase and ERK. 2) The small GTPase Rab family are involved in membrane trafficking pathways. We have identified novel members of the RIN family as guanine nucleotide-exchange factors (GEFs) for Rab5. The RIN family, which contains many functional domains, such as SH2, Pro-rich region (binding to SH3), Vps9 (GEF), and RA (Ras-association), appear to act as adaptors or scaffold proteins in early steps of the endocytic pathway. 3) We have also identified novel family of Ras-like small GTPases, Di-Ras, Rheb, which might be involved in membrane trafficking pathways. Rheb expression in culture cells induced formation of the cytoplasmic large vacuoles, which are characterized as late endocytic (late endosome-and lysosome-like) components. Rheb appears to regulate the internalization of glutamate transporter in glial cells.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2003 -2003 
    Author : 仁科 博史; 荒木 保弘; 星野 真一; 堅田 利明
     
    ERK、SAPK/JNK、p38の3種に大別されるMAPキナーゼシグナル伝達系は、様々な細胞応答に関与する主要なリン酸化酵素である。申請者らは、これらシグナル系の発生や免疫における生理的な役割を明らかにする目的でノックアウトマウスの作出や特異的な阻害剤を用いた解析を行っている。本年度の成果として、発生時の肝形成にはSAPK/JNKの活性化が必須あること,その活性化にはSEK1とMKK7の2種類の活性化因子が協調的に働いている可能性を示した(J.Biol.Chem.278;16595-16601,2003)。また、SEK1とMKK7を欠損しSAPK/JNKの活性化が完全に失われた細胞を作出し、ストレス応答性のアポトーシス誘導に関して検討を加えた。先の報告とは異なりストレス応答性のアポトーシス誘導にはSAPK/JNKの活性化は必須でないことを明らかにした(J.Biol.Chem.279;1621-1626,2004)。さらにFcγ受容体やfMLP受容体による好中球の活性酸素産生において、ERKがアダプター分子のGab2を直接リン酸化すること,その結果PI3キナーゼの活性化が促進されるという興味深い知見を見い出した。ERKの標的分子を見い出すという本研究目的の一つを達成した(J.Immunol.171;4227-4234,2003)。一方、放射標識された非天然型のATPアナログの合成とこれをリン酸化反応の基質として利用可能な点変異MAPキナーゼを作製することによって、変異MAPキナーゼだけが標的分子に放射標識されたγ位のリン酸基を転移できるような実験系では実用化に向けて、高非活性のATPアナログの合成や細胞膜を透過しにくい非天然型ATPアナログを細胞内に導入する条件が検討されている。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2003 -2003 
    Author : 荒木 保弘; 星野 真一; 仁科 博史; 堅田 利明
     
    真核細胞には、転写・複製中のエラーや不適切なスプライシングにより生じる未成熟な翻訳終結コドン(ナンセンス変異)を含むmRNAを選択的に分解するNMD(Nonsense-mediated mRM decay)と呼ばれる監視機構が存在している。この作用により、ナンセンス変異をもつ転写産物からC末端側が欠失したタンパク質は生成されない。これまでNMD経路では、通常のmRNA分解と異なり、3'→5'方向の分解は介在しないと考えられていた。先に我々は、新規G蛋白質Ski7が真核細胞の3'からのmRNA分解に寄与することを示した。平成15年度は、このG蛋白質を中心に、3'からのmRNA分解とNMD経路の関連について、酵母を用いた解析から検討を進め、以下の知見を得た。 1、3'→5'方向の分解関連因子の破壊株において、ナンセンス変異を含むmRNAが蓄積することを見出し、NMD経路においても3'→5'方向の分解が寄与することを明らかにした。さらにNMDの3'→5'方向のmRNA分解には、通常のmRNA分解における3'→5'分解機構、すなわち{mRNA分解酵素の本体であるエキソソーム、その補助因子のSki複合体、そして両複合体の共役因子であるSki7が必要であった。2、ナンセンス変異を含むmRNAの3'→5'方向の分解が促進しており、この活性化には、NMD経路で機能するUp咽子群が寄与していることを見出した。3、Upf因子群と3'からの分解関連因子との相互作用の有無を検討したところ、Ski7との相互作用を見出した。さらにSki7上のUpf因子相互作用部位を同定し、野生株に過剰発現することにより、ナンセンス変異を含んだmRNAの3'→5'方向の分解が特異的に阻害された。以上の結果から、Ski7G蛋白質とUpf因子群間の相互作用が、NMD経路の分解促進に必要であることが示された。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2002 -2003 
    Author : HOSHINO Shin-ichi; ARAKI Yasuhiro; NISHINA Hiroshi; KATADA Toshiaki
     
    The last step of gene expression is translation termination, in which synthesized polypeptide chain is released from the ribosome. So far, the termination is thought to occur only for terminating the translation reaction. During the course of investigation of the translation termination factor eRF3/GSPT, we have found that the translation termination is coupled to two post-termination events. One is mRNA decay and the other is translation initiation; the terminating ribosome is efficiently recycled to the next round of translation initiation in a manner coupled to translation termination, while at the same time, the translated mRNA is subjected to degradation. Therefore, transition termination is strongly suggested to be a regulatory step in gene expression. In the present study, we analyzed the detailed molecular mechanism of the termination-coupled mRNA decay. Translation termination is coupled to the shortening of poly(A) tail of mRNA, which is a first late limiting step of mRNA decay. One of the two major mRNA deadenylase, PAN, is involved in the termination coupled poly(A) shortening. As in the case with the yease Saccharomyces cerevisiae, human PAN, we have identified in this study, is involved in the deadenylation of mRNA. hPAN competes with eRF3/GSPT for binding to PABP, a poly(A)-binding protein which binds to the 3' poly(A) tail of mRNA, and the translation termination factor is replaced by hPAN as the translation progresses. Thus, hPAN is activated by PABP to degrade the poly(A) tail of the mRNA in a manner coupled to translation termination. On the other hand, we have also found that eRF3/GSPT is involved in the regulation of apoptosis. eRF3/GSPT is cleaved at the PABP-binding site, and the processed eRF3/GSPT binds to an apoptosis inhibitor IAP to release activated caspases, leading to apoptosis. Also, translation termination might be a target of translation inhibition during apoptosis.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2000 -2003 
    Author : 仁科 博史; 荒木 保弘; 星野 真一; 堅田 利明; 紺谷 圏二
     
    マスト細胞上に存在するIgE受容体(FcεRI)の刺激は、主にサイトカイン遺伝子の発現とヒスタミンやセロトニンを含む細胞内顆粒の放出を介して、アレルギーや炎症反応に深く寄与している。これら2種の生理応答に関わる細胞内のシグナル伝達系として、それぞれPI3-キナーゼの活性化と細胞内Ca^<2+>の上昇が重要視されているが、MAPキナーゼ系の役割については未だに不明な点が多い。申請者らは、これらシグナル系の生理的な役割を明らかにする目的でノックアウトマウスの作出や特異的な阻害剤を用いた解析を行っている。本年度の成果として、我々は先ずストレス応答性のMAPキナーゼであるSAPK/JNKの活性化機構を検討した。その結果、SAPK/JNKの活性化にはSEK1とMKK7の2種類の活性化因子が協調的に働いていることを明らかにした(J.Biol.Chem. 278;16595-16601,2003)。また、同じく免疫担当細胞の一つである好中球のFcγ受容体やfMLP受容体による活性酸素産生において、ERKがアダプター分子のGab2を直接リン酸化すること,その結果PI3キナーゼの活性化が促進されるという興味深い知見を見い出した(J.Immunol.171;4227-4234,2003)。次に我々は、MAPキナーゼ系の阻害剤を用いてマスト細胞の生理機能に及ぼす影響を検討した。その結果、SAPK/JNK阻害薬のSP600125によってFcεRI刺激によるサイトカイン遺伝子発現も顆粒放出も顕著に抑制されることを見い出した。しかしながら、この薬剤による抑制効果はSAPK/JNK阻害によるものでないことを、SAPK/JNK活性化の時間経過やMKK7欠損マスト細胞を用いて明らかにしている。現在までに、SP600125の作用点はPI3-キナーゼより上流に位置する分子であることを見い出しており、この作用点の解明から、サイトカイン遺伝子発現や顆粒放出に必須の役割を果たす分子の解明を目指している。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2002 -2002 
    Author : 仁科 博史; 荒木 保弘; 星野 真一; 堅田 利明
     
    ERK、SAPK/JNK、p38の3種に大別されるMAPキナーゼファミリーは、様々な細胞応答に関与する主要なリン酸化酵素である。申請者らは最近、紫外線照射時のERKやJNK、p38の活性化機構やその生理的役割を検討し、ERKの活性化にはSrcからのEGF受容体の活性化という細胞膜近傍での反応が必要であること、また細胞のアポトーシス誘導の関与が示唆されているJNKやp38とは対照的に、ERKが抗アポトーシスに関与することを明らかにした(J.Biol.Chem.277;366-371,2002)。しかしながら、これらのMAPキナーゼが標的とするリン酸化分子やそれらの生理的役割については不明のままである。一般に、細胞内あるいは細胞抽出液内に存在するプロテインキナーゼの標的分子を同定することは困難な場合が多い。この原因の一つは、共存する多数多種類のキナーゼが一斉にリン酸化反応を行い、目的のリン酸化反応を覆い隠してしまうことにある。そこで本研究では、放射標識された非天然型のATPアナログの合成とこれをリン酸化反応の基質として利用可能な点変異MAPキナーゼを作製することによって、変異MAPキナーゼだけが標的分子に放射標識されたγ位のリン酸基を転移できるような実験系の開発を行った。これまでに野生型リン酸化酵素が利用できない非天然型ATPアナログを利用可能な点変異JNKは作製済みであり、同様な方法で、p38やERKの点変異体も作製した。現在これら変異体の特性を検討中である。また、細胞膜を透過しにくい非天然型ATPアナログを細胞内に導入する目的で、刺激依存的にJNKが活性化される環境を保持しつつ、非天然型ATPアナログが細胞内に取り込まれる条件を、各種可溶化剤やサポニンを用いて検討中である。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2002 -2002 
    Author : 堅田 利明; 荒木 保弘; 星野 真一; 仁科 博史
     
    真核生物には、転写・複製中のエラーや不適切なスプライシングによって生じたナンセンス変異をもつmRNAを選択的に分解する機構として、UPF因子群が介在するnonsense-mediated decay (NMD)経路が存在する。このNMDの作用によりナンセンス変異をもつ転写産物からC末端側が欠失した蛋白質が翻訳されることは通常ない。先に申請者らは、翻訳終結に関わるG蛋白質eRF3を単離し、このeRF3ファミリーに属する新規G蛋白質であるSki7が細胞質におけるmRNA分解の基本的因子であることを初めて明らかにした。本研究においては、以下に示すように、NMDには新規な分解経路が介在すること、さらにこの分解経路にはUPF因子群とSki7間の相互作用が必要であることを見出した。これは、UPF因子群とmRNA分解マシーナリーの機能的関連を示した初めての知見であり、ナンセンス変異がNMDを活性化する機構を理解する上で大きな手掛かりであると考える。 1、既知のNMD分解経路を抑制してもナンセンス変異をもつmRNAの分解は促進する。2、新規な分解経路は、UPF因子群のみならずSki7も必要である。3、Ski7はUPF因子群と相互作用する。4、Ski7のUPF因子群相互作用部位の強制発現により、新規経路を介した分解のみが抑制される。 多くの遺伝病はナンセンス変異が原因としており、そのmRNAはNMDによりが潜在化している。ナンセンス変異を含む転写産物をNMDから回避させることによって遺伝病原因遺伝子を同定し、より良い治療法を見出せる可能性もあり、上記の知見はNMD経路を標的とした新しい遺伝病の診断・治療法への応用にも有用である。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2002 -2002 
    Author : 星野 真一; 荒木 保弘; 仁科 博史; 堅田 利明
     
    G蛋白質GSHTファミリーは、翻訳伸長因子EF1αと相同なC末端側領域に加えて、ファミリー間で相同性の低いN末端領域を有する。先に我々は、GSPTがC領域を介して終止コドンを認識する翻訳終結因子eRF1と結合しeRF3として機能することを、さらにN領域を介してポリA尾部結合蛋白質であるPABPの機能を制御することを報告した。平成14年度においては、主に酵母を用いた解析から、GSPTファミリーによるmRNAの分解制御についてさらに検討を加え以下の知見を得た。 1、mRNA分解の律速段階はポリA尾部の短縮化にあるが、GSPTのN領域欠失変異体ではmRNAのポリA鎖の短縮化が阻害され、引き続くmRNA分解が遅延した。すなわち、GSPTは翻訳終結において、そのC領域を介してeRF1を終止コドンに運搬して翻訳を終結させた後、さらにN領域を介してPABPと相互作用し、翻訳を終えたmRNAの分解を促進するという、GTP蛋白質が介在する新規のシグナル伝達経路が証明された。2、GSPTとeRF1との結合はGSPTへのGTPの結合を必要とし、一方のGSPTとPABPとの結合はGSPTへのヌクレオチド結合に非依存的であった。3、mRNA分解は翻訳終結反応と共役しており、この共役はGSPTによって伸介された。4、さらにGSPTとPABPとの相互作用は、5'-キャップ構造と3'-ポリA尾部によるmRNAの環状化に依存した翻訳の効率化にも影響を与え、リボソームの再雇用に積極的な役割を果たすことを見出した。5、eRF3と最も相同性の高いG蛋白質eRFSは、そのC末端側領域でeRF1に類似の分子eRFLとGTP依存的に結合し、一方のN末端領域は、解糖系酵素のGAPDHとの結合を介して特定(AU-rich)のエレメントを有するmRNAの動態を制御する可能性を見出した。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2001 -2002 
    Author : NISHINA Hiroshi; ARAKI Yasuhiro; HOSHINO Shin-ichi; KATADA Toshiaki
     
    Mice lacking stress-signaling kinase SEK1 die from embryonic day 10.5 (El0.5) to E12.5. Although a defect in liver formation is accompanied with the embryonic lethality of sek1-/- mice, the mechanism leading to the liver defect has remained unknown. Here we investigated liver development in sek1-/- embryos using a monoclonal antibody specifically recognizing murine hepatoblasts and genetic interaction of sek1 with proto-oncogene c-jun and tumor necrosis factor-α receptor 1 gene, tnfrl, which are also responsible for liver formation and the cell apoptosis. There was a progressive increase in the hepatoblast cell numbers of wild-type embryos from E10.5 to 12.5. The hepatoblast proliferation required no hematopoiesis, since transcription factor AML1-deficient mice had no defect in the cell growth. Instead, impaired hepatoblast proliferation was observed in sekl-/- livers from E10.5, though fetal liver-specific gene expression was normal. The impaired phenotype in sek1-/- livers was more severe than in c-jun-/- embryos, and sek1-/- c-jun-/- embryos more rapidly died before E8.5. Stimulation of stress-activatied protein kinase/c-Jun N-terminal kinase by hepatocyte growth factor was attenuated in sek1-/- livers. The defective liver formation in sek1-/- embryos was not protected by additional tnfr1 mutation that rescues the embryonic lethality of mice lacking NF-kB signaling components. Thus, SEK1 appears to play a crucial role in hepatoblast proliferation and survival in a manner apparently different from c-Jun or NF-kB.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2001 -2001 
    Author : 堅田 利明; 紺谷 圏次; 星野 真一; 仁科 博史
     
    Rab5は細胞膜からの小胞出芽、小胞間の融合や初期エンドソームへの融合など、細胞外からの物質輸送や受容体のエンドサイトーシスにおいて重要な役割を果す低分子量のG蛋白質である。先に我々は、GTP結合型のRab5と相互作用する分子を酵母のtwo hybrid系等を用いて探索し、Rab5に結合する複数の新規分子(RINファミリー)を単離・同定したが、本研究では、RINファミリー分子の性状を解析し、Rab5との相互作用について以下の知見を得た。 1.Rab5結合蛋白質RINファミリーには、N末端から、SH2ドメイン、SH3ドメインが結合するProに富む配列、Rabのグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)として機能し得るVps9ドメイン、Rasとの結合が推定されるRAドメインなど、多くの機能領域が共通に存在した。2.RINファミリーの個々のメンバーは、ヒトの各組織間で異なる発現パターンを示した。3.RIN2はGDP-Rab5よりもGTP-Rab5に対してより結合親和性が高く、さらにGEFの活性も有した。4.RIN2は、C末端側及びN末端側同士で会合し、ホモ4量体を形成するというユニークな性状を示した。5.HeLa細胞でのRIN2の細胞内局在について検討した結果、G1, S, G2前期ではRab5と同じ小胞に共局在しているが,細胞周期に依存してM期特異的に核内に移行するという興味深い局在変化を見出した。6.このRIN2の核内移行は、活性化型であるRab5変異体の導入で促進され、不活性化型Rab5変異体導入によって完全に抑制された。 これらの知見は、細胞膜受容体刺激のシグナルがRINファミリー分子を介してRab5に伝達され、さらにRINがRab5の下流で機能する可能性を示唆している。また、Rab5は機能分子の核内移行をも制御する可能性が生まれた。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2001 -2001 
    Author : 仁科 博史; 紺谷 圏二; 星野 真一; 堅田 利明
     
    MAPキナーゼファミリー(ERK, SAPK/JNK, p38)は、様々な細胞応答に関与する主要なリン酸化酵素である。申請者らは最近、紫外線照射時のERKやSAPK/JNK, P38の活性化機構やその生理的役割を検討し、ERKの活性化にはSrcからのEGF受容体の活性化という細胞膜近傍での反応が必要であること、細胞のアポトーシス誘導の関与が示唆されているSAPK/JNKやp38とは対照的にERKは抗アポトーシスに関与することを明らかにした(J. Biol. Chem. 277 ; 366-371, 2002)。しかしながら、これらMAPキナーゼが如何なる標的分子をリン酸化してこのような生理的役割を果たすかについては不明のままである。 一般に、細胞内あるいは細胞抽出液内に存在するプロテインキナーゼの標的分子を同定することは困難な場合が多い。この原因の一つは、共存する多数多種類のキナーゼが一斉にリン酸化反応を行い、目的のリン酸化反応を覆い隠してしまうことにある。そこで本研究では、アイソトープラベルされた非天然型のATPアナログの合成とこれをリン酸化反応の基質として利用可能な点変異MAPキナーゼを作製することによって、変異MAPキナーゼだけが標的分子にアイソトープラベルされたγ位のリン酸基を転移できるような実験系の開発を行った。これまでに野生型リン酸化酵素が利用できない非天然型ATPアナログを利用可能な点変異JNKは作製済みであり、同様な方法で、p38やERKの点変異体も作製した。現在これら変異体の特性を検討中である。また、利用可能な変異JNKを用いて肝臓のミトコンドリア画分中の標的分子を探索したところ、分子量約30kDaのタンパク質が特異的にリン酸化されることを見出した。現在このタンパク質の同定が進行中である。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2001 -2001 
    Author : 紺谷 圏二; 星野 真一; 仁科 博史; 堅田 利明
     
    ヒトの前立腺癌の転移の抑制に関わる染色体17番目に存在する新たな癌抑制遺伝子の候補として、sek1遺伝子が、ポジショナルクローニングによって同定された。sek1遺伝子は、ストレス応答性のMAPキナーゼSAPK/JNKを活性化するMAPキナーゼキナーゼSEK1/MKK4をコードする。興味深いことに、ヒトの膵癌、胆癌、肺癌でも、sek1遣伝子の変異を示す症例が続々と報告された。本研究では、既に作出済みのSEK1欠損ES細胞や、SEK1と同様にSAPK/JNKを活性化するSEK2/MKK7を欠損するES細胞を用いて、その増殖能・腫瘍形成能および免疫担当細胞の増殖に及ぼす影響を個体レベルで明らかにすることを目的として、以下の知見を得た。 1)野生型、sek1(-/-)、mkk7(-/-)の遺伝子型に関わらずES細胞の増殖はほぼ同様であった。 2)妊娠17日目のマウスにブサルファンを投与し、免疫能の低下した新生児マウスを作出後、これらの肝臓に各種遺伝子型のES細胞を移植し、腫瘍形成能を検討した。4週間後、ブサルファン投与群では約30%で腫瘍の形成が確認されたが、遺伝子型による差異は観察されなかった。 3)一方興味深いことに、mkk7(-/-)ES細胞を用いて作出されたキメラマウスから調製された胸腺T細胞やB細胞、マスト細胞などの免疫担当細胞では、増殖刺激に対して過増殖することが観察された(J. Ekp. Med. 17;757-768,2001)。 以上の結果は、細胞の種類によつてはSAPK/JNK活性化因子であるMAPキナーゼキナーゼが増殖抑制因子として関与することを示唆するが、ヒトの各種癌から推測されている癌抑制遺伝子機能との関わりについては不明のままであり、更なる解析が必要である。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2001 -2001 
    Author : 星野 真一; 紺谷 圏二; 仁科 博史; 堅田 利明
     
    G蛋白質GSPTファミリーは、翻訳伸長因子EF1αと相同なC末端側領域に加えて、ファミリー間で相同性の低いN末端領域を有する。先に我々は、GSPTがC領域を介して終止コドンを認識する翻訳終結因子eRF1と結合し、eRF3として機能することを、さらにN領域を介してポリA尾部結合蛋白質であるPABPの機能を制御することを見出した。本研究においては、主に酵母を用いた解析から、GSPTファミリーによるmRNAの分解制御について検討を加えた。 mRNA分解の律速段階はポリA尾部の短縮化にあるが、GSPTのN領域欠失変異体では、mRNAのポリA鎖の短縮化が阻害され、それに引き続くmRNA分解が遅延した。すなわち、GSPTは翻訳終結において、そのC領域を介してeRF1を終止コドンに運搬して翻訳を終結させた後、さらにN領域を介してPABPと相互作用し、翻訳を終えたmRNAの分解を促進するという、GTP蛋白質が介する新規のシグナル伝達経路が証明された。また、GSPTと近縁のG蛋白質であるSki7は、そのN領域を介してmRNAの3'側方向からの分解に介在するSki複合体とエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソソーム複合体に結合することを見出した。さらに別のG蛋白質HBS1においては、その破壊株でAU rich配列を有するmRNAの半減期が遅延し、HBS1のN末端にはAU rich配列結合蛋白質であるグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)が結合する知見を得た。AU rich配列へのGAPDHの結合は、HBSによって阻害されるので、HBSはmRNA AU rich配列に結合しているGAPDHと競合して、mRNAの分解を促進する可能性が高い。 このように、GSPT(eRF3)ファミリーに属するG蛋白質は、そのN領域を介してmRNAの動態を調節するという、共通した制御機構の存在が明らかにされた。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2000 -2001 
    Author : HOSHINO Shin-ichi; KONTANI Kenji; NISHINA Hiroshi; KATADA Toshiaki
     
    Translation termination in eukaryote is governed by the two termination factors eRF1 and eRF3/GSPT. GSPT is a GTP-binding protein consisting of unique N-terminal domain and Ef1a-like C-terminal domain. GSPT carries eRF1, which recognizes all three termination codons, to the A site of the ribosome and promotes release of synthesized polypeptide chain from the ribosome. For this reaction the C-domain but not the N-domain of GSPT is demonstrated to be required and sufficient. In the present study, we investigated functional roles of the N-domain of GSPT. To gain insight into this issue, we first screened a binding partner of the N-domain of GSPT by the yeast two-hybrid system and identified polyadenylate binding protein (PABP1), which is suggested to function in the regulation of mRNA stability and translation initiation. By the use of yeast genetics and biochemical approaches, we demonstrated that GSPT interact with PABP to function as a regulator of both ribosomal shunting and mRNA degradation. These processes are coupled to translation termination. Thus after regulating translation termination, GSPT is found to participate in the next round of translation initiation and degradation of the used mRNA. In addition to GSPT, structurally homologous genes were identified. eRFS is one of the most homologous genes and has similar two-domain structure, though the function has not been determined. In this study, we also found that the C-domain of eRFS interacts with a novel gene product, eRFL, which we newly identified as a structural homologue of eRF1. In contrast N-domain of eRFS is found to interact functionally with GAPDH, which is known not only as a key glycolytic enzyme but also as an AU-rich element binding protein. These results suggest that in analogous to GSPT, eRFS also functions in the regulation of gene expression at the level of translation and mRNA metabolism.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2000 -2001 
    Author : NISHINA Hiroshi; KONTANI Kenji; HOSHINO Shin-ichi; TAKADA Toshiaki
     
    Mice lacking stress-signaling kinase SEK1 die from embryonic day 10.5 (E10.5) to E12.5. Although a defect in liver formation is accompanied with the embryonic lethality of sek1-/- mice, the mechanism leading to the liver defect has remained unknown. Here we investigated liver development in sek1-/- embryos using a monoclonal antibody specifically recognizing murine hepatoblasts and genetic interaction of sek1 with proto-oncogene c-jun and tumor necrosis factor-α receptor 1 gene, tnfr1, which are also responsible for liver formation and the cell apoptosis. There was a progressive increase in the hepatoblast cell numbers of wild-type embryos from E10.5 to 12.5. The hepatoblast proliferation required no hematopoiesis, since transcription factor AML1-deficient mice had no defect in the cell growth. Instead, impaired hepatoblast proliferation was observed in sek1-/- livers from E10.5, though fetal liver-specific gene expression was normal. The impaired phenotype in sek1-/- livers was more severe than in c-jun-/- embryos, and sek1-/- c-jun-/- embryos more rapidly died before E8.5. Stimulation of stress-activatied protein kinase/c-Jun N-terminal kinase by hepatocyte growth factor was attenuated in sek1-/- livers. The defective liver formation in sek1-/- embryos was not protected by additional tnfr1 mutation that rescues the embryonic lethality of mice lacking NF-κB signaling components. Thus, SEK1 appears to play a crucial role in hepatoblast proliferation and survival in a manner apparently different from c-Jun or NF-κB.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2000 -2000 
    Author : 仁科 博史; 紺谷 圏二; 星野 真一; 堅田 利明
     
    ストレス応答性のMAPキナーゼシグナル伝達系であるSAPK/JNK系は、生体防御に関わるT細胞の活性化やTh1/Th2細胞分化の制御に関与することが明らかにされている。SAPK/JNKを活性化する因子としてSEK1とMKK7が存在し、それぞれがSAPK/JNK分子内のThr-Pro-Tyr配列中のThrとTyrの両残基をリン酸化する(dual-specificity)キナーゼとして機能すると考えられている。我々はSEK1やMKK7のレベルからSAPK/JNK系の生理的役割を研究してきたが、その過程でSAPK/JNK活性化に関して興味深い現象を見出している。T細胞活性化刺激剤であるホルボールエステルとカルシウムイオノフォアで末梢T細胞や胸腺T細胞を刺激すると、ともに強いSAPK/JNKの活性化が観察される。しかしながら、SEK1欠損の末梢T細胞では野生型と同等のSAPK/JNKの活性化が認められるのに対して、胸腺T細胞ではSAPK/JNKの活性化はほぼ完全に消失したのである。これらの結果は、SAPK/JNK活性化の分子機構がT細胞の種類によって異なる制御を受けている可能性を示唆している。そこで、細胞内で起きているSEK1とMKK7によるSAPK/JNKの活性化やリン酸化の程度を定量的に検討し、1)これまではThrとTyrの両残基をリン酸化するキナーゼ(dual-specificity kinase)と考えられてきたSEK1とMKK7だが、SEK1はThr-Pro-Tyr配列のTyr残基を、MKK7は主にThr残基をリン酸化すること、2)両残基のリン酸化によってSAPK/JNKは相乗的に活性化されることを明らかにした。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1999 -2000 
    Author : KATADA Toshiaki; KONTANI Kenji; HOSHINO Shin-ichi; NISHINA Hiroshi
     
    Ecto-form NADase activity induced by retinoic acid (RA) in human HL-60 cells is due to CD38, which has an amino acid sequence homologous to Aplysia ADP-ribosyl cyclase. CD38 catalyzes not only the hydrolysis of NAD^+, but also the formation and hydrolysis of cyclic ADP-ribose (cADPR), that is a novel mediator or modulator of Ca^<2+> release from intracellular Ca^<2+> stores. In the present study, we investigated the functions and properties of CD38 and its related ecto-enzyme, PC-1. 1. CD38 was capable of hydrolyzing the N-glycoside bond of many compounds other than NAD^+. 2. CD38 was abundantly present in rat astrocytes in addition to lymphocytes, and the cell-surface CD38 was rapidly inactivated upon incubation with the enzyme substrates. 3. Soluble and membrane-bound forms of PC-1, which had been induced in human Jurkat T cells upon culture with a cAMP analog, were identified and characterized enzymatically and structurally. 4. Both PC-1 molecules possessed phosphodiesterase/pyrophosphatase activity, and the enzymic activity of soluble PC-1 could be utilized to search for its interacting molecules. 5. Glycosaminoglycans, such as heparin and heparan sulfate in extracellular matrix, were capable of binding to PC-1 and inhibited its phosphodiesterase activity in a manner competing with the enzyme substrates. 6. A homologue of human PC-1 was also present in C.elegans, and it possessed phosphodiesterase/pyrophosphatase activity. The enzymic activity was localized in the cell surface. Thus, PC-1 may function as an adhesion molecule to associate with glycosaminoglycans in extracellular matrix.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1999 -1999 
    Author : 堅田 利明; 紺谷 圏二; 星野 真一; 仁科 博史
     
    先に我々は,GTP結合蛋白質GSPTがC末端側領域に存在する翻訳伸長因子EF1αと相同な領域を介して翻訳終結因子eRF1と相互作用し,翻訳終結因子eRF3として機能するとこと,さらに,N末端側領域を介してmRNAの3'末端poly(A)尾部結合蛋白質(PABP)と結合してmRNAの分解過程にも関与している可能性を見い出してきた。 本研究においては,酵母においてもGSPTとPABPが相互作用しうることを示し,酵母温度感受性変異株gst1において,poly(A)^+-mRNAの分解過程に異常が生じていることを明らかにした。また,GSPTをmulticopy vectorで細胞に導入すると,mRNAの半減期が短縮され,分解の促進が実際に観察された。さらに,GSPTと最も近縁の遺伝子産物である酵母HBSlは,GSPT同様のドメイン構造を有しているが,このHBS1のNドメインと相互作用する因子の検索を行い,グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を同定した。GAPDHは糖代謝系の酵素である一方で,ポリゾーム画分にも存在し、mRNAの3'非翻訳領域に存在するAU-richなRNAに高親和性に結合する蛋白質としても同定されている。したがって,これらの実験事実は,GSPT,HBS1が,共にNドメインにおいて3'非翻訳領域に結合するRNA結合蛋白質との相互作用を介しmRNAの安定性を制御しているという共通の機構の存在を強く示唆している。さらに,GSPTに対しグアニンヌクレオチド依存性に結合する因子を単離し,これがヌクレオチド二リン酸キナーゼ(NDPK)であることを見出した。GSPTにGTPを供給する機構,あるいはGSPTに対するGEF,GAPとしての機能等が期待され,現在解析中である。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1999 -1999 
    Author : 仁科 博史; 紺谷 圏二; 星野 真一; 堅田 利明
     
    SEK1/MKK4やSEK2/MKK7は、炎症性サイトカインなどの様々なストレス刺激に応答し、SAPK/JNKを活性化するキナーゼである。我々の成果を含め多くの報告が、T細胞の活性化やTNFαによる細胞応答にSEK2を介すSAPK/JNKの活性化の重要性を指摘している。本年度は、以下の諸点を明らかにした。 1)Cre-loxPを用いた条件付き遺伝子破壊法によって、sek2遺伝子破壊を誘導した。興味深いことに、SEK2欠損よって既にES細胞レベルで致死になることが判明した。 2)SEK1ノックアウトマウスの解析から、SEK1欠損マウスは肝臓形成に必須の役割を果たすことを明らかにしてきたが、造血の場である胎児肝の形成過程と造血との関わりを詳細に解析するために、胎児肝を特異的に認識するモノクローナル抗体を複数作製した。このうちの一つ抗Liv1抗体は胎児肝を特異的に染色した。興味深いことに、SEK1欠損胎児肝にはLiv1陽性細胞は観察されなかった。また、成体肝では、Liv1陽性細胞は肝実質細胞に比べて小さな細胞として少数しか存在しないことが明らかになった。肝幹細胞である可能性を検討中である。 3)SAPK/JNK系は、T細胞の活性化やThl/Th2分化の制御、あるいは、アポトーシス誘導や生存シグナルとしても機能することが示唆されている。c-Junを代表とする既存の標的分子だけでは、上記の生理機能を理解することは不充分であると考え、新規標的分子を探索した。その結果、成体マウス肝の核画分よりc-Junとは異なる分子量40kのタンパク質が、SAPK/JNKの良い基質となることが明らかとなった。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1999 -1999 
    Author : 堅田 利明; 紺谷 圏二; 星野 真一
     
    先に我々は,チロシンキナーゼ型とG蛋白質共役型という2種の異なる受容体刺激によって相乗的に活性化されるイノシトールリン脂質3-キナーゼ(PI3K)として,110-kDaβ触媒(p110β)/85-kDa調節(p85)サブユニットからなる2量体型PI3Kを同定した。本研究では,この分子種のPI3Kを中心にさらに解析を進め,以下の知見を得た。1.構成的に活性化型のp110β-PI3Kと相互作用する分子を酵母のtwo-hybrid系を用いて検索し,低分子量GTPaseファミリーのRab5を同定した。2.Ser/ThrキナーゼのAkt(PKB)は,PI3Kの産物であるPIP3により活性化されるが,インスリン刺激に応答するAktの活性化は,活性化型Rab5の遺伝子導入で増強され,不活性化型Rab5により抑制された。すなわち,チロシンキナーゼ受容体からPI3Kを介するAktの活性化に,Rab5の介在が初めて示された。3.活性化型Rab5の相互作用分子をtwo-hybrid系を用いて検索し,SH2ドメインをもつ新規分子群を同定した。4.エフェクターとしての役割が期待される新規Rab5結合蛋白質群は,初期エンドソームに局在化することが示され,小胞輸送におけるRab5の機能解析の基礎が築かれた。5.リンパ球細胞において,Fcγ受容体刺激でチロシンリン酸化されるPI3Kのアダプター分子として,癌遺伝子産物p120^と100-kDa蛋白質を同定した。100-kDa蛋白質は、G蛋白質共役型受容体刺激によりそのセリン/スレオニン残基がリン酸化されるというユニークな挙動を示し,Gab2であることを見出した。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1999 -1999 
    Author : 仁科 博史; 紺谷 圏二; 星野 真一
     
    c-jun遺伝子産物の活性を制御するMAPキナーゼファミリーのSAPK/JNK系は、発がんやストレス応答、アポトーシスに関与する主要な細胞内情報伝達経路を構成すると考えられている。SAPK/JNK活性化因子SEK1/MKK4やSEK2/MKK7を中心に、c-JunやSEK1欠損マウス、またSEK2欠損細胞を用いて、以下の諸点を明らかにした。 1.c-Jun欠損マウスもSEK1欠損マウスもともに、肝実質細胞数の低下とその後のアポトーシスの亢進により胎生致死となるが、その程度はSEK1欠損の方がc-Jun欠損より重度であった。 2.SEK2欠損ES細胞は致死となった。SEK2は細胞の生存に必須の役割りを果たしていることが示唆された。 3.胎児肝特異的なモノクローナル抗体抗を複数作製した。このうちの一つ抗Liv1抗体は胎児肝を特異的に染色した。興味深いことに、SEK1欠損胎児肝にはLiv1陽性細胞は観察されなかった。また、成体肝では、Liv1陽性細胞は肝実質細胞に比べて小さな細胞として少数しか存在しないことが明らかになった。肝幹細胞である可能性を検討中である。 4.成体肝の核画分よりc-Junとは異なる分子量40kのタンパク質が、SAPK/JNKの良い基質となることが明らかになった。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1998 -1999 
    Author : NISHINA Hiroshi; KONTANI Kenji; HOSHINO Shin-ichi; KATADA Toshiaki
     
    The stress signal kinase SEK1/MKK4 is a direct activator of stress-activated protein kinase (SAPKs ; also called c-Jun-N- terminal kinases, JNKs) in response to a variety of cellular stresses, such as changes in osmolarity, metabolic poisons, DNA damages, heat shock or inflammatory cytokines. We have disrupted the sek1 gene in mice using homologous recombination. Sek1ィイD1-/-ィエD1 embryos displayed severe anemia and died between embryonic day 10.5(E10.5) and E12.5. In the present study, we investigated the functions and properties of SEK1 and its related kinase, SEK2/MKK7. 1. Hematopoiesis and vasculogenesis are normal in sek1ィイD1-/-ィエD1 embryos. However, hepatogenesis and liver formation were severely impaired in the mutant embryos and E11.5 and E12.5 sek1ィイD1-/-ィエD1 embryos had greatly reduced numbers of parenchymal hepatocytes. Sek1ィイD1-/-ィエD1 liver cells underwent massive apoptosis. These results provide the first genetic link between SEK1 and organogenesis in mammals and indicate that SEKI provides a crucial and specific survival signal for hepatocytes. 2. We disrupted the sek2 gene in mouse embryonic stem (ES) cells using the Cre-10xP system. Sek2ィイD1-/-ィエD1 ES cells did not grow and died, Thus. SEK2 is a crucial survial molecule for ES cells. 3. We prepared monoclonal antibodies to mouse fetal liver. One of them, anti-Liv1 specifically recognized hepatocytes in wild-type embryos, but not in sek1ィイD1-/-ィエD1 embryos. These results indicate that SEK1 regulates Liv1 expression and fetal liver development.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1998 -1999 
    Author : KATADA Toshiaki; KONTANI Kenji; HOSHINO Shin-ichi; NISHINA Hiroshi
     
    Stimulation of G protein-coupled receptors (GPCRs) by agonists induces the dissociation of the signal coupling proteins into GTP-bound α and βγ subunits (Gβγ). In addition to the α subunit, Gβγ has recently been shown to regulate activities of effector enzymes or ion channels. In the present study, we investigated the molecular mechanisms by which βγ subunits regulate the effector activities. Moreover, we studied phosphatidylinositol 3-OH kinase (PI 3-kinase) consisting of p110β catalytic and p85 regulatory subunits, which is synergistically activated by the stimulation of GPCRs and tyrosine-kinase receptors. 1. The first WD motif of Gβγ appeared to be involved in the stimulation of GィイD2sィエD2-dependent activation of type-2 adenylyl cyclase. In contrast, the third and sixth motifs of Gβγ interacted with Raf-1 kinase in yeast two-hybrid system. 2. Lipid kinase activity of p110β/p85 PI 3-kinase was synergistically stimulated by Gβγ and a tyrosine-phosphorylated peptide. 3. The small GTPase, Rab5, was identified as one of p110β-binding proteins in yeast two-hybrid system. In in vitro-binding experiments, p110β was indeed capable of associating with GTP-bound Rab5. However, such interaction was not observed with GDP-bound Rab5 or the various forms of Ras. 4. In cultured cells, insulin-induced activation of protein kinase B (Akt), which is the target enzyme of PI 3-kinase product, appeared to be simulated by active Rab5 and inhibited by the dominant-negative form. 5. A novel effector for Rab5, which contained SH2 domain, was also identified in yeast two-hybrid system, and the effector appeared to present in early endosomes. 6. Gab 2 was identified as one of adaptor molecules involved in signal transduction pathway from Fcγ receptors to PI 3-kinase, and the adaptor was phosphorylated in Tyr and Ser/Thr residues upon stimulation of Fcγ and chemotactic peptide (GPCR) receptors.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1998 -1998 
    Author : 堅田 利明; 星野 真一; 仁科 博史
     
    申請者の研究グループは、レチノイン酸によるヒトHL-60細胞の好中球への分化過程でエクト型NAD分解酵素 (NADase) が細胞表層に誘導され、この酵素活性がリンパ球表面抗原のCD38によることを先に明らかにした。本研究では、細胞表層上の新しい機能分子と期待されるCD38及びその関連分子PC-1に関わる細胞内シグナル伝達機構、酵素化学的特性、及び転写制御機構などを検討し、以下の知見を得た。1、CD38の基質特異性について検討し、CD38はNAD以外に多様な化合物のN-グリコシド結合を切断し、ニコチンアミドを遊離する特性を示した。2、ラットCD38を認識するポリクローナル抗体を用いた解析から、CD38はアストロ細胞に強く発現することを見出した。また、アストロ細胞表層のCD38は酵素反応の進行にともない何らかの化学修飾を受けて不活性化された。3、CD38の反応産物のADP-riboseは、老化への関与が指摘されている翻訳御修飾であるadvanced glycation end products(AGE)化のよい供与体となることが示された。4、糖鎖修飾を受けたCD38と結合する50-kDaタンパク質をリンパ組織に見出した。5、ヒトCD38遺伝子の遺伝子発現について解析し、核内レチノイン酸受容体のRAR(α)/RXRが結合する応答配列が第1イントロン上に存在することを見出した。6、構造上CD38に類似したPC-1にはホスホジエステラーゼ活性が存在するが、Jurkat Tリンパ球細胞をdibutyryl cAMPで処理すると、膜結合型の発現に加えて可溶性型のPC-1が分泌された。7、膜貫通型および分泌型PC-1の酵素学的な性状に差異はなく、両酵素はPC-1 mRNAの翻訳産物から異なるプロセッシングによって生じる可能性が示された。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1998 -1998 
    Author : 仁科 博史; 星野 真一; 堅田 利明
     
    MAPキナーゼファミリーの一つであるSAPK/JNK系は、DNA損傷、紫外線照射、熱ショック、虚血、炎症性サイトカインなどの様々なストレス刺激によって活性化されることから、発がんやストレス応答、アポトーシスに関与する主要な細胞内情報伝達経路を構成すると考えられている。私どもはこれまでに、SAPK/JNKの活性化を直接制御するキナーゼ,SEK1(JNKK1/MKK4)の遺伝子破壊実験を行い、新規SAPK/JNK活性化因子SEK2/MKK7の単離・同定や、SAPK/JNK系がT細胞の活性化や生存維持、またマウスの個体発生における器官形成にも深く関与することを明らかにしてきた。本研究では、SAPK/JNK系の免疫応答及びマウス発生についてさらなる解析を行い、以下の知見を得た。1.in vitroで抗CD3抗体とIL-2で末梢T細胞を活性化し、再度抗CD3抗体で刺激すると、このT細胞はアポトーシスを引き起こす。SEK1を欠損するT細胞は野生型と比べてアポトーシスの亢進が観察された。興味深いことに、抗CD3抗体で誘導される抗アポトーシス分子であるBcl-X_Lの発現がSEK1欠損T細胞では低下しており、SEK1が生存シグナルを伝達している可能性が示唆された。2.SEK1欠損T,B細胞を有するキメラマウスの解析から、ウイルスに対する個体全体の免疫系は、SEK1欠損によってほとんど影響を受けないこと、この原因としてSEK2/MKK7による相補機能が示唆された。3.ノックアウトマウスの解析から、SEK1欠損マウスは肝臓形成不全により、胎生期12.5日で致死になることが明らかになった。肝実質細胞の増殖・分化の低下とその後のアポトーシスの抗進が観察され、これが肝臓の形成不全の原因であることが示唆された。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1998 -1998 
    Author : 堅田 利明; 星野 真一; 仁科 博史
     
    本研究では、チロシンキナーゼ型とG蛋白質共役型という2種の受容体刺激によって相乗的に活性化されるイノシトールリン脂質3-キナーゼ(PI3K)について解析し、以下の知見を得た。1、チロシンリン酸化を引き起こすインスリンとG_i-共役型受容体のアゴニストである化学走化性因子fMLPの両者で好中球細胞を刺激すると、相乗的なPI3Kの活性化が観察された。2、こうした2種の異なる受容体刺激によるPI3Kの相乗的な活性化は、脂肪細胞におけるインスリンとアデノシン受容体刺激、リンパ球細胞におけるFcγとfMLP受容体刺激などでも観察され、それぞれ糖取り込みの促進、活性酸素産生という細胞応答と密接に関連した。3、インスリンとfMLP受容体を安定に発現した培養細胞株の解析から、PI3Kの相乗的活性化はAkt/PKBプロテインキナーゼとS6キナーゼの活性化及びアクチン線維の再形成による膜ラッフリングの増大とよい相関を示した。4、チロシンリン酸化ペプチドとG-βγによって相乗的に活性化されるPI3Kとして、110-kDaβ-触媒/85-kDa調節サブユニット2量体を同定した。5、リンパ球細胞において、Fcγ受容体刺激でチロシンリン酸化されるPI3Kのアダプター蛋白質として、癌遺伝子産物p120^と100-kDa蛋白質を見出した。100-kDa蛋白質は、G蛋白質共役型受容体刺激によりそのセリン/スレオニン残基がリン酸化されるというユニークな挙動を示した。6、構成的に活性化型の110-kDaβ-型 PI3Kと相互作用する分子を酵母のtwo-hybrid系を用いて検索した結果、低分子量GTPaseファミリーのRab5が見出された。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1998 -1998 
    Author : 仁科 博史; 星野 真一; 堅田 利明
     
    c-jun遺伝子産物の活性を制御するMAPキナーゼファミリーのSAPK/JNK系は、DNA損傷、紫外線照射、熱ショック、虚血、炎症性サイトカインなどの様々なストレス刺激によって活性化されることから、発がんやストレス応答、アポトーシスに関与する主要な細胞内情報伝達経路を構成すると考えられている。私どもはこれまでに、SAPK/JNKの活性化を直接制御するキナーゼ,SEK1(JNKK1/MKK4)の遺伝子破壊実験を行い、新規SAPK/JNK活性化因子SEK2/MKK7の単離・同定や、SAPK/JNK系がT細胞の活性化や生存維持、またマウスの個体発生における器官形成にも深く関与することを明らかにしてきた。本研究では、SAPK/JNK系の免疫応答及びマウス発生についてさらなる解析を行い、以下の知見を得た。 1.in vitroで抗CD3抗体とIL-2で末梢T細胞を活性化し、再度抗CD3抗体で刺激すると、このT細胞はアポトーシスを引き起こす。SEK1を欠損するT細胞は野生型と比べてアポトーシスの亢進が観察された。興味深いことに、抗CD3抗体で誘導される抗アポトーシス分子であるBcl-X_Lの発現がSEK1欠損T細胞では低下しており、SEK1が生存シグナルを伝達している可能性が示唆された。2.SEK1欠損T,B細胞を有するキメラマウスの解析から、ウイルスに対する個体全体の免疫系は、SEK1欠損によってほとんど影響を受けないこと、この原因としてSEK2/MKK7による相補機能が示唆された。3.ノックアウトマウスの解析から、SEK1欠損マウスは肝臓形成不全により、胎生期12.5日で致死になることが明らかになった。肝実質細胞の増殖・分化の低下とその後のアポトーシスの抗進が観察され、これが肝臓の形成不全の原因であることが示唆された。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1997 -1998 
    Author : 星野 真一
     
    先に申請者の研究グループは、レチノイン酸によるヒトHL-60細胞の好中球への分化過程でエクト型NAD分解酵素(NADase)が細胞表層に誘導され、この酵素活性がリンパ球表面抗原のCD38によることを明らかにした。本研究では、細胞表層上の新しい機能分子と期待されるCD38及びその関連分子に関わる細胞内シグナル伝達機構、酵素化学的特性、及び転写制御機構などを検討し、以下の知見を得た。1、CD38の基質特異性について検討し、CD38はNAD以外に、ニコチンアミドを有するNMNなどの多様な化合物のN-グリコシド結合を切断することが示された。2、ラットCD38を認識するポリクローナル抗体を作製して中枢組織での局在を解析した結果、CD38はアストロ細胞に強く発現していた。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察から、細胞表層のCD38は酵素反応の進行にともない何らかの化学修飾を受けて不活性化されることが明らかにされた。3、CD38の反応産物のADP-riboseは、老化への関与が指摘されている翻訳御修飾であるadvanced glycation end products(AGE)化のよい供与体となることが示された。4、糖鎖修飾を受けたCD38と結合する50-kDaタンパク質をリンパ組織に同定し、CD38のNADase活性がレクチンとの結合により阻害されることを見出した。5、ヒトCD38遺伝子の遺伝子発現について解析し、核内レチノイン酸受容体のRAR(α)/RXRが結合する応答配列が第1イントロン上に存在することを見出した。6、構造上CD38に類似したPC-1にはホスホジエステラーゼ活性が存在するが、PC-1 mRNAの翻訳産物から異なるプロセッシングによって、膜貫通型および分泌型酵素が産生する可能性が示された。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1997 -1998 
    Author : HIZEKI Osamu; OKAMURA Naoki; KUROKAWA Tomonori
     
    Wortmannin, a potent inhibitor of phosphoinositide 3-kinase, and its derivatives were utilized to investigate the functions of the enzyme. 1. A novel catalytic subunit of phosphoinoside 3-kinase was isolated by use of a radiolabeled derivative of wortmannin. This subunit had a primary structure very similar to the beta-subtype of phosphoinositide 3-kinase. The novel subtype and the beta-subtype were found to be synergistically activated by a tyrosine-phosphorlated peptide and beta/gamma subunits of GYP-binding proteins. The alpha and gamma subtypes did not show the similar property. 2. The above synergism in vitro was operating in intact cell systems including rat adipocytes. The synergism was also observed as the cellular activity of protein kinase B, a downstream target of phosphoinositide 3-kinase. Thus a functional difference between the subtypes of the lipid kinase was newly suggested. 3. Wortmannin was found to inhibit the in vitro adhesion and motility of highly metastatic hepatoma cells. The effect was reproduced by introducing a dominant-negative mutant of phosphoinositide 3-kinase to the cells. Thus the enzyme was suggested to regulate the metastatic activity of hepatoma cells. 4. Derivatives of wortmannin lacking an ability to bind covalently to phosphoinositide 3-kinase were found. The compounds are expected to be utilized as ligands for affinity chromatography.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1997 -1998 
    Author : KATADA Toshiaki; HOSHINO Shin-ichi; NISHINA Hiroshi
     
    Ecto-form NADase activity induced by retinoic acid(RA)in HL-60 cells is due to CD38, which has an amino acid sequence homologous to Aplysia ADP-ribosyl cyclase. CD38 catalyzes not only the hydrolysis of NAD^+, but also the formation and hydrolysis of cyclic ADP-ribose (cADPR), that is a novel mediator or modulator of Ca^<2+> release from intracellular Ca^<2+> stores. In the present study, we investigated the functions and properties of CD38 and its related ecto-enzyme, PC-1.1. Stimulation of RA-differentiated HL-60 cells with anti-CD38 monoclonal antibodies induced rapid tyrosine phosphorylation of cellular proteins including the c-cbl proto-oncogene product, pl20^. Superoxide formation in response to formyl-Met-Leu-Phe was markedly enhanced by the anti-CD38 mAbs. Fcgamma-II receptors appeared to be involved in the signal transduction pathway mediated through the anti-CD38 mAb-induced tyrosine phosphorylation. 2. CD38 was abundantly present in rat brain in addition to lymphocytes. In primary culture of rat glial and neuronal cells, CD38 was most abundantly observed in astrocyte cell surface. Confocal laser microscopic analysis revealed that immunoreactive CD38 and the enzyme activity were localized on the cell surface of astrocytes. The cell-surface CD38 was rapidly inactivated upon the addition of the enzyme substrates to the cultured astrocytes. 3. An RA response element (RARE) consisting of two direct-repeated TGACCT-like hexamer motifs with a 5-nucleotide spacer was found to be located in the first intron of CD38 gene. This RARE interacted with heterodimer composed of RA receptor and retinoid X receptor. Thus, the RA-induced expression of human CD38 gene was demonstrated to be mediated through the RARE located in the first intron.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1997 -1998 
    Author : KATADA Toshiaki; HOSHINO Shin-ichi; NISHINA Hiroshi; MALAVASI Fabio; MEHTA Kapil
     
    Ecto-form NADase activity induced by retinoic acid (RA) in HL-60 cells is due to CD38, which has an amino acid sequence homologous to Aplysia ADP-ribosyl cyclase. CD38 catalyzes not only the hydrolysis of NAD^+, but also the formation and hydrolysis of cyclic ADP-ribose (cADPR), that is a novel mediator or modulator of Ca^<2+> release from intracellular Ca^<2+> stores. In the present study, we investigated the functions and properties of CD38 and obtained the following findings. 1. Stimulation of RA-differentiated HL-60 cells with anti-CD38 monoclonal antibodies induced rapid tyrosine phosphorylation of cellular proteins including the c-cbl proto-oncogene product, p12O^. Superoxide formation in response to formyl-Met-Leu-Phe was markedly enhanced by the anti-CD38 mAbs. Fcgamma-II receptors appeared to be involved in the signal transduction pathway mediated through the antiCD38 mAb-induced tyrosine phosphorylation. 2. CD38 was abundantly present in rat brain in addition to lymphocytes. In primary culture of rat glial and neuronal cells, CD38 was most abundantly observed in astrocyte cell surface. Confocal laser microscopic analysis revealed that immunoreactive CD38 and the enzyme activity were localized on the cell surface of astrocytes. The cell-surface CD38 was rapidly inactivated upon the addition of the enzyme substrates to the cultured astrocytes. 3. An RA response element (RARE) consisting of two directrepeated TGACCT-like hexamer motifs with a 5-nucleotide spacer was found to be located in the first intron of CD38 gene. This RARE interacted with heterodimer composed of RA receptor and retinoid X receptor. Thus, the RA-induced expression of human CD38 gene was demonstrated to be mediated through the RARE located in the first intron.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1997 -1997 
    Author : 櫨木 修; 仁科 博史; 星野 真一; 堅田 利明
     
    本研究においては、インスリンの作用を増強するというGタンパク質活性化刺激の効果の分子機構を明らかにし、さらに、その生理的意義を確立するための基礎検討を行った。ラット脂肪細胞をインスリンで刺激したときのグルコースの取り込み速度増大は、同時に百日咳毒素感受性Gタンパク質を活性化することで顕著に増強された。また、CHO細胞をインスリン刺激したときの膜ラッフルの形成もこのGタンパク質を活性化することで顕著に増強された。これらの細胞応答は、イノシトールリン脂質3キナーゼの阻害薬であるワ-トマニンにより完全に抑制されるものであり、Gタンパク質による細胞応答の増強は細胞内におけるイノシトールリン脂質3キナーゼ産物(PIP3)の蓄積増大を伴うものであった。このとき,イノシトールリン脂質3キナーゼの下流に位置していると推定されているプロテインキナーゼBの相乗的活性化も観察された。これらの細胞内には、インスリン受容体刺激によって産生されるチロシンリン酸化蛋白質と活性化型G蛋白質によって相乗的に活性化れるという興味深い性質をもつイノシトールリン脂質3キナーゼ活性が存在し、その本体として、βサブタイプのイノシトールリン脂質3キナーゼを同定した。以上の結果は、インスリンの生理作用の発現においてG蛋白質共役型受容体の活性化状態が許容的に制御するという機構の存在を示すものであり、今後、糖尿病治療薬の開発などの応用面においてもユニークな視座を与えるものと考えられる。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1997 -1997 
    Author : 堅田 利明; 星野 真一; 仁科 博史; 櫨木 修
     
    先に申請者の研究グループは、レチノイン酸によるヒトHL-60細胞の好中球への分化過程でエクト型NAD分解酵素(NADase)が細胞表層に誘導され、この酵素活性がリンパ球表面抗原のCD38によって担われることを明らかにした。本研究では、細胞表層上の新しい機能分子と期待されるCD38及びこれと関連するプリンヌクレオチド代謝酵素につき、それらの生理機能と酵素化学的特性、転写調節の機構などを検討し、以下の知見を得た。1.IgG_1サブクラスに属する抗CD38モノクローン抗体でリンパ球系の細胞を刺激すると、複数の細胞内機能蛋白質がチロシンリン酸化されたが、この作用はCD38抗体のFc部分がFcγII受容体を刺激した結果であった。2、ラット脳の初代培養法により、各種のグリア、神経細胞を分取してラットCD38の局在を解析した結果、CD38はアストロ細胞に強く発現しており、またその細胞表層には顕著なNADase活性が認められた。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察から、アストロ細胞のCD38は斑点(cluster)状の構造をとり、基質NADの添加によって細胞内陥入(internalization)することが明らかにされた。3、これらリンパ球系と神経系の細胞表層には、CD38とは別にヌクレオチドを基質とするPC-1様の酵素(phyrophosphatase/phosphodiesterase)活性が存在し、その一部は分泌型の性状を示した。4、推定された分泌型PC-1のN末端配列を決定し、プロセッシング部位を同定した。5、ヒトCD38遺伝子の遺伝子発現について解析し、核内レチノイン酸受容体のRAR(α)/RXRが結合する応答配列が第1イントロン上に存在することを見出した。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1997 -1997 
    Author : 櫨木 修; 仁科 博史; 星野 真一; 堅田 利明
     
    イノシトールリン脂質3キナーゼを活性化する様々な受容体刺激がMAPキナーゼの活性化を導き、また、イノシトールリン脂質3キナーゼの強力な阻害薬であるワ-トマニンがMAPキナーゼの活性化を抑制するとの現象が知られている。しかし、このワ-トマニンの作用はイノシトールリン脂質3キナーゼ阻害に基づかないと報告されている。本研究では、放射標識をおこなったワ-トマニン誘導体を有効に用いることによって、この場合のワ-トマニン標的分子を明らかにすることを企図していた。上記の報告は、ある種のドミナントネガティブ型のイノシトールリン脂質3キナーゼの発現が、ワ-トマニン様の作用を示さないとの観察結果に基づくものである。しかし、今回、イノシトールリン脂質3キナーゼを活性化できない変異PDGF受容体や活性型変異イノシトールリン脂質3キナーゼを用いた解析結果から、少なくともCHO細胞においては、MAPキナーゼの活性化機構におけるイノシトールリン脂質3キナーゼの役割を否定できなかった。今後、ワ-トマニンのMAPキナーゼ活性化抑制作用の発現におけるイノシトールリン脂質3キナーゼ阻害効果の寄与の程度を明らかにしたいと考えている。また、この場合、ワ-トマニンの作用はMAPキナーゼ上流に位置することが報告されているRasの活性化阻害を伴うものであり、その分子機構の解明が今後の重要な課題である。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1997 -1997 
    Author : 櫨木 修; 仁科 博史; 星野 真一; 堅田 利明
     
    ラット肝臓、脳の細胞質画分のPI3K活性は、チロシンリン酸化蛋白質とヘテロ三量体型G蛋白質の解離したβγサブユニット(Gβγ)により、相乗的に上昇した。このような性質をもつ活性を2種類、ラット肝臓より部分精製し、特異的抗体などを用いた性状解析をおこなったところ、1種についてはPI3Kのβサブタイプ(p110β)であることが明らかになった。リコンビナント酵素を用いた解析では、既知の3種類のサブタイプのうち、p110βのみが相乗的活性化を受けることを観察した。THP-1細胞、脂肪細胞などにおいては、チロシンキナーゼ型受容体(インスリン受容体)とG蛋白質共役型受容体の同時刺激により、PI3K産物の蓄積が相乗的に増大する。このとき、PI3Kの下流に位置することが指摘されているPKBの活性も相乗的活性化を受けた。同様の現象は、2種類の受容体(インスリン受容体と走化性因子受容体)を強制発現させたCHO細胞においても観察された。従って、PI3Kの協調的調節機構は細胞レベルにおいても機能しているものと考えられた。現在、Gβγの作用部位を決定するとともに、ドミナントネガティブに機能するp110βの作成を目指している。また、NGF刺激によるPC12細胞の神経突起の伸長が、PI3K阻害薬ワ-トマニン、LY294002によって抑制されるとの報告を確認した。PI3Kの役割をさらに明確にするために、活性型PI3Kの発現、ドミナントネガティブPI3K、PKBの発現実験を行う。また、上記、協調的調節機構が機能している可能性を探る予定である。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1997 -1997 
    Author : 堅田 利明; 星野 真一; 仁科 博史; 櫨木 修
     
    イノシトールリン脂質(PI)の3位水酸基をリン酸化する2量体型PI3-キナーゼ(PI3-K)は、その調節サブユニットに存在するSrc homology 2(SH2)領域を介して増殖因子受容体あるいは非受容体型キナーゼによってチロシンリン酸化された基質蛋白質と結合し、活性化される。先に申請者らは、真菌代謝産物のワ-トマニンがPI3-Kを特異的に阻害すること、また好中球での走化性因子に応答した活性酸素産生など、G蛋白質連関型受容体刺激を介する速い細胞応答にもPI3-Kが関与することを見い出した。本研究では、2種の細胞膜受容体ファミリー、すなわちチロシンキナーゼ型とG蛋白質連関(7回膜貫通)型という異なるタイプの受容体刺激によって相乗的に活性化されるPI3-Kについて検討し、以下の知見を得た。1、インスリンと走化性因子の受容体を発現させたCHO細胞では、両受容体刺激による相乗的なPI3-Kの活性化が観察され、この増強作用は膜ラッフリングの増大を伴った。2、ラット肝臓より種々のタイプのPI3-Kを精製して検討を加えた結果、チロシンリン酸化ペプチドとGβγによって相乗的に活性化されるPI3-Kは、その触媒サブユニットがβタイプである2量体ファミリーと推定された。4、この酵素化学的特性は、COS細胞に種々のタイプのPI3-K遺伝子を導入した解析結果からも確認された。5、PI3-K調節サブユニットのSH2領域に結合するアダプター蛋白質として、受容体刺激でチロシンリン酸化される癌遺伝子産物p120^と新規の100-kDa蛋白質を同定した。さらに後者の100-kDa蛋白質は、G蛋白質連関型受容体刺激によりそのセリン/スレオニン残基がリン酸化された。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1996 -1997 
    Author : KATADA Toshiaki; HOSHINO Shin-ichi; NISHINA Hiroshi; HAZEKI Osamu
     
    Ecto-form NADase activity induced by retinoic acid (RA) in HL-60 cells is due to CD38, which has an amino acid sequence homologous to Aplysia ADP-ribosyl cyclase. CD38 catalyzes not only the hydrolysis of NAD^+, but also the formation and hydrolysis of cyclic ADP-ribose (cADPR), that is a novel mediator or modulator of Ca^<2+> release from intracellular Ca^<2+> stores. In the present study, we developed a radioimmunoassay (RIA) for cADPR measurement and obtained the following findings. 1.Stimulation of RA-differentiated HL-60 cells with anti-CD38 monoclonal antibodies (IgG1-subcless) induced rapid tyrosine phosphorylation of cellular proteins including the c-cbl proto-oncogene product, p120^. Superoxide formation in response to formyl-Met-Leu-Phe was markedly enhanced by the anti-CD38 mAbs. Fcgamma-II receptors appeared to be involved in the signal transduction pathway mediated through the anti-CD38 mAb-induced tyrosine phosphorylation. 2.CD38 was abundantly present in rat brain in addition to lymphocytes. In primary culture of rat glial cells and neurons, CD38 was most abundantly observed in astrocyte cell surface. Confocal laser microscopic analysis revealed that immunoreactive CD38 and the enzyme activity were localized on the cell surface of astrocytes in a dot-like shape. The cell-surface CD38 was clustered and internalized upon the addition of the enzyme substrates to the cultured astrocytes. This internalization accompanied with the increase of intracellular cADPR.3.An RA response element (RARE) consisting of two directrepeated TGACCT-like hexamer motifs with a 5-nucleotide spacer was found to be located in the first intron of CD38 gene. This RARE interacted with heterodimer composed of RA receptor and retinoid X receptor. Thus, the RA-induced expression of human CD38 gene was demonstrated to be mediated through the RARE located in the first intron. 4.An increase in cellular cADPR was observed upon the fertilization of see urchin eggs.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1996 -1997 
    Author : HAZEKI Osamu; NISHINA Hiroshi; HOSHINO Shin'ichi; KATADA Toshiaki
     
    Two types of phosphoinositide 3-kinase (PI 3-kinase), in terms of the mechanism of activation, had been recognized. One is stimulated by a tyrosine-phosphorylated peptide (PY). The other is activated by the betagamma subunits of GTP-binding proteins (GBgamma). In the present study, we found the activity which is stimulated by both PY and GBgamma in a synergistic manner. The activity was identified to be the beta-subtype of PI 3-kinase. In rat adipocyted, cell production of phsphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate, a product of PI 3-kinase, increased synergistically by insulin (tyrosine kinase-activating) and adenosine (G-protein-activating). Similar results were observed in the CHO cells artificially transfected with the insulin and fMLP receptors. Insulin actions on these cells (glucose uptake, memrane ruffling) were effectively potentiated by simultaneous stimulation of the GTP-binding proteins. This effect of GTP-binding proteins was accompanied by the potentiation of insulin-induced activation of protein kinase B,a putative downstream target of PI 3-kinases. The results indicated a novel role of GTP-binding proteins, a permissive regulation of the insulin receptor-derived signal.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1996 -1996 
    Author : 堅田 利明; 星野 真一; 櫨木 修
     
    我々は、先に細菌毒素の触媒するADPリボシル化反応を利用して、三量体G蛋白質の同定と機能解明に多大に貢献してきた経験をもつが、これらの研究成果を背景として、最近ラットのTリンパ球アロ抗原RT6がADPリボシルトランスフェラーゼの酵素活性をもつことを見出し、単離されたリンパ球表層上でRT6の自己ADPリボシル化が進行するとを明らかにした。RT6はTりんぱ球の成熟過程において何らかの関与が示唆されている表面抗原であり、またその分子の欠損したラットにおいては、インスリン依存性糖尿病が頻発するなど病態との関連も示唆されている。本研究では、細胞外に触媒部位をもつ他のプリンヌクレオチド代謝酵素との対比を含めて、RT6のもつ酵素活性を解析し、以下の知見を得た。 1.RT6.1分子のアミノ酸点変異体(Gln^<207>→Glu^<207>)が、本分子のもつADPリボシルトランスフェラーゼ活性を著しく上昇させることを見いだし、他のADPリボシル化酵素に共通なEEEVLIP[207-213]配列が本酵素の活性にも重要なアミノ酸であることを明らかにした。2.RT6分子の2つのアロタイプ(RT6.1とRT6.2)について、それぞれ大腸菌で発現させたリコンビナント体を用いて検討したところ、NADグリコヒドロラーゼ活性には、2つのアロタイプ間において大きな相違は認められないが、RT6.2のADPリボシルトランスフェラーゼ活性はRT6.1に比べて約10倍高いことが明らかにされた。3.また、ラット胸腺細胞をレチノイン酸で処理すると、RT6のADPリボシル化活性が誘導されるが、この活性はRT6.2分子の発現誘導によることを明らかにした。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1996 -1996 
    Author : 徳光 幸子; 星野 真一
     
    3T3-L1繊維芽細胞はインスリン、デキサメサゾンおよびイソブチルメチルキサンチン(IBMX)の3種の混合液(分化誘導薬)を添加して培養することにより、脂肪細胞へ分化する。これら3者の薬物は各々脂肪細胞への分化に対して重要な役割を担っているがその中でも、インスリンが重要な役割を担っていることが分かった。すなわち、脂肪細胞特有の性質である脂肪合成酵素系の活性化による中性脂肪の蓄積およびグルコーストランスポーター4型の発現によるグルコース取り込みの亢進はインスリンの作用によるものである。したがって、3T3-L1繊維芽細胞の脂肪細胞への分化に対するインスリンの情報伝達系を中心に検討した結果、以下のことが明らかとなった。(1)インスリンによる脂肪酸合成の亢進は抑制性のGTP結合蛋白質Giの機能を消失させた百日咳毒素処理によって著しく抑制された。(2)インスリンはイノシトールグリカン特異的ホスホリパーゼC(P1-PLC)の活性化を引き起こしたが、百日咳毒素処理はこのPI-PLCの活性化を抑制した。(3)PI-PLCの活性化はdiacylglycerolの生成を伴い、C kinaseの活性化を引き起こす。そこで、直接C kinaseを活性化させるPMAを添加すると、脂肪細胞への分化は抑制され、C kinaseを消失させるPMAの長時間処理は逆に分化を増強させた。(4)各種の細胞において、増殖や分化の過程にプロトオンコジーンの発現が起こることが報告されている。3T3-L1繊維芽細胞に分化誘導薬を添加すると、c fos発現が認められ、百日咳毒素処理はこの発現を完全に阻害した。分化誘導薬中のIBMXが3T3-L1繊維芽細胞の増殖を抑えていたことから、百日咳毒素処理は分化の過程に必須なc fos発現を阻害したと推定した。 以上の結果から、インスリンによる3T3-L1繊維芽細胞の脂肪細胞への分化の過程に百日咳毒素感受性のGi蛋白質が介在し、PI-PLCの活性化→ →c fos発現→ →脂肪細胞への分化が起こるものと推定した。一方、C kinaseの活性化は脂肪細胞への分化を負に調節していると結論した。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1996 -1996 
    Author : KATADA Toshiaki; HOSHINO Shin-ichi; KAZEKI Osamu
     
    The human cell surface antigen CD38, which has an amino acid sequence homologous to Aplysia ADP-ribosyl cyclase, is a 46-kDa type II glycoprotein with a single-transmembrane domain. We previously demonstrated that the extracellular domain of CD38 exhibits NAD^+ glycohydrolase (NADase) activity and that the ecto-form NADase activity induced by all-trans retinoic acid (RA) in HL-60 cells is due to CD38. CD38 catalyzes not only the hydrolysis of NAD^+ but also the formation and hydrolysis of cyclic ADP-ribose, which is a novel candidate that mediates Ca^<2+> release from intracellular Ca^<2+> stores. In the present study, we obtained the following findings. 1. Stimulation of RA-differentiated HL-60 cells with anti-CD38 monoclonal antibodies (mAbs) induced rapid tyrosine phosphorylation of cellular proteins with the molecular weights of 120,000,87,000 and 77,000. One of the prominent phosphorylated proteins was identified as the c-cbl proto-oncogene product, p120^.2. Superoxide formation in response to formyl-Met-Leu-Phe was markedly enhanced by the anti-CD38 mAbs in the differentiated HL-60 cells. 3. The epitopes recognized by these agonistic mAbs stimulating protein tyrosine phosphorylation were all mapped on the same carboxyl-terminal sequence of CD38, and the same sequence was also required for its ecto-NADase activity. 4. Fcgamma-II receptors appeared to be involved in the signal transduction pathway mediated through the agonistic anti-CD38 mAb-induced tyrosine phosphorylation of cellular proteins. 5. The expression of CD38 mRNA was mediated through nuclear RA receptors ; a RA receptor-responsive element was present in the first intron of CD38 gene.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1996 -1996 
    Author : 櫨木 修; 星野 真一; 堅田 利明
     
    イノシトールリン脂質(PI)のD-3位水酸基をリン酸化するPI3-キナーゼ(PI3-K)は、その調節サブユニットに存在するSrc homology2領域を介して、増殖・分化因子受容体あるいは非受容体型キナーゼによってチロシンリン酸化された基質蛋白質と結合する。先に我々は、真菌代謝産物のワ-トマニンがPI3-Kを特異的に阻害すること、また走化性因子などのG蛋白質連関型受容体の刺激を介した速い細胞応答にもPI3-Kが関与することを見い出した。本研究では、NGFによるPC12細胞の分化におけるPI3-Kの関与に加えて、チロシンキナーゼ型とG蛋白質連関(7回膜貫通)型という異なるタイプの受容体刺激によって活性化されるPI3-Kについて検討し、以下の知見を得た。 1.PC12細胞において、NGFやスフィンゴミエリナーゼはPI3-Kを活性化し、突起進展を促進したが、両者の作用はともにワ-トマイニンと別のPI3-K阻害薬であるLY294002によって抑制された。2.インスリンと走化性因子の両者で無傷好中球を刺激した際には、相乗的なPI3-Kの活性化が観察され、2種の異なる受容体刺激の制御を受けるPI3-Kが生理的にも機能していることが示された。3.CHO細胞においても観察され得る上記の増強作用は、アクチン線維の再形成による膜ラッフリングの増大を伴った。4.ラット肝臓より種々のタイプのPI3-Kを精製して検討を加えた結果、チロシンリン酸化ペプチドとGβγによって相乗的に活性化される特性をもつPI3-Kは、βタイプを触媒サブユニットにもつファミリーであることが明らかにされた。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1996 -1996 
    Author : 堅田 利明; 星野 真一; 櫨木 修
     
    イノシトールリン脂質(PI)のD-3位水酸基をリン酸化するPI3-キナーゼ(PI3-K)は、その調節サブユニットに存在するSrc homology2領域を介して、増殖因子受容体あるいは非受容体型キナーゼによってチロシンリン酸化された基質蛋白質と結合する。我々は、真菌代謝産物のワ-トマニンがPI3-Kを特異的に阻害すること、また好中球での走化性因子刺激に応答した活性酸素産生など、G蛋白質連関型受容体刺激を介する速い細胞応答にもPI3-Kが関与することを見い出した。本研究では、2種の細胞膜受容体ファミリー、すなわちチロシンキナーゼ型とG蛋白質連関(7回膜貫通)型という異なるタイプの受容体刺激によって活性化されるPI3-Kについて検討し、以下の知見を得た。 1.PI3-Kにはいくつかのファミリーが存在するが、好中球細胞ではG蛋白質βγサブユニット(Gβγ)に感受性があるタイプとして、チロシンリン酸化ペプチドには全く感受性を示さないものと、リン酸化ペプチド存在下にGβγによる活性化がさらに増強されるものが存在した。2.インスリンと走化性因子の両者で無傷好中球を刺激した際には、相乗的なPI3-Kの活性化が観察され、2種の受容体刺激の制御を受けるPI3-Kが生理的にも機能していることが示された。3.CHO細胞においても認められる上記の増強作用は、アクチン線維の再形成による膜ラッフリングの増大を伴った。4.ラット肝臓より種々のタイプのPI3-Kを精製して検討を加えた結果、チロシンリン酸化ペプチドとGβγによって相乗的に活性化される特性をもつPI3-Kは、βタイプを触媒サブユニットにもつファミリーであることが明らかにされた。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1995 -1996 
    Author : KATADA Toshiaki; ISHIKAWA Yoshihiro; HOSHINO Shin-ichi; HAZEKI Osamu
     
    GTP-binding protein (G proteins) consisting of alpha, beta, gamma subunits, carry signals from membrane receptors to effectors such as enzymes or ion channels. G proteins dissociate into the GTP-bound alpha and betagamma subunits upon their interaction with agonist-receptor complex. In the present studies, we investigated mechanisms by which the activities of adenylyl cyclase and phosphatidylinositol (PI) 3-kinase are regulated by G proteins, especially the betagamma subunits. In guinea pig neutrophils, the cellular cAMP formation by prostagladin (PG) E_1 was markedly potentiated by the chemoattractant formyl-Met-Leu-Phe (fMLP). This potentiation was abolished by prior treatment of the cells with pertussis toxin, but not by the prevention of fMLP-induced intracellular Ca^<2+> increase in the cells, indicating the direct involvement of the inhibitory G protein (G_i) in the fMLP-induced potentiation of cAMP formation. Adenylyl cyclase responsible for the G_i-induced potentiation was partially purified from the GTPgammaS-treated cell membranes with a forskolin-agarose column. The cyclase appeared to be a complex form with the GTPgammaS-bound alpha subunit of the stimulatory G_S protein (G_Salpha), but not with the betagamma subunits. The GTPgammaS-bound G_Salpha-stimulated cyclase activity was further enhanced by betagamma subunits. These results indicate that GTP-bound G_Salpha and betagamma subunits released from G_i synergistically stimulate adenylyl cyclase activity in neutrophils. In relation to this, we also found that the activity of PI 3-kinase is inhibited by wortmannin and that several types of PI 3-kinase are stimulated by bg subunits. Interestingly, a peptide containing phosphorylated Tyr and betagamma subunits synergistically activated a certain type of PI 3-kinase. Such synergistic activation was also observed in intact neutrophil-like cells upon their stimulation with insulin and fMLP.Thus, G_i activation appeared to have a cross-talk with Tyr-phosphorylation signaling pathway via betagamma subunits in PI 3-kinase.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1995 -1995 
    Author : 星野 真一
     
    我々は先に、NAD^+を基質とした細菌毒素の触媒するG蛋白質のADPリボシル化の研究を背景に、レチノイン酸(RA)によるHL-60細胞の好中球への分化過程にNAD^+分解酵素が誘導され、その酵素がヒトリンパ球表面抗原のCD38分子によることを明らかにした。CD38はアメフラシの卵精巣より単離されたADPリボース環化酵素と構造上類似し、さらに生成物である環状ADPリボースは、IP_3と同様にある細胞内プールからCa^<2+>を放出させる作用をもつことから、この新規環上ヌクレオチドは細胞内で新たなシグナル分子として機能することが期待された。本研究では、細胞内外でNAD^+を基質とする代謝酵素が情報伝達系において果たす生理的役割、また哺乳動物における環状ADPリボースの産生機構、並びにNAD^+分解酵素とADPリボース環化酵素との触媒活性の差異を生じさせる機構の解明を目的とし、以下の知見を得た。1. RA-分化HL-60細胞を抗CD38単クローン体抗体で刺激すると、いくつかの細胞内蛋白質がチロシンリン酸化されたが、その一つを120kDaのc-cbl遺伝子産物と同定した。2.この抗CD38単クローン性抗体刺激によって、化学遊走因子の受容体を介するHL-60細胞の活性酸素産生が増強された。3. Zn^<2+>がCD38に作用すると、そのNAD^+分解活性が抑制され、ASPリボース環化活性は逆に促進された。すなわち、Zn^<2+>によるCD38の酵素特性の転換が認められた。4. CD38遺伝子の第1イントロン内には、RAによってその抑制が解除されるnegative regulatory element (NRE)が存在し、RA(受容体)を介する新しい転写調節機構の存在が推定された。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1995 -1995 
    Author : 櫨木 修; 星野 真一; 堅田 利明
     
    神経細胞の分化調節に果たすリン脂質代謝変動の意義に関して以下の様な新しい知見をえた。 (1)PC12細胞の分化を促すNGFの作用は、細胞内のPI3キナーゼの活性化を伴う (2)PC12細胞をスフィンゴミエリナーゼで処理することによっても分化が促進され、このとき、細胞内のPI3キナーゼの活性化が観察される (3)細胞をあらかじめPI3キナーゼの阻害薬であるワ-トマニンやLY294002で処理しておくと、NGF,スフィンゴミエリナーゼの分化促進作用が減弱する (4)スフィンゴミエリナーゼは細胞内のさまざまな蛋白質のチロシンリン酸化をひきおこすが、NGF受容体をチロシンリン酸化することはない (5)スフィンゴミエリナーゼはSwiss 3T3細胞においても、MAP kinase,focal adhesion kinase,paxillinを含む多種の蛋白質をチロシンリン酸化するが、この場合にはPI3キナーゼの活性化は認められない。 以上の結果は、PC12細胞の分化調節にはPI3キナーゼが何らかの重要な役割を果たしている可能性を示すものである。また、種々の細胞で報告されているスフィンゴミエリナーゼの多様な作用の発現には、細胞内チロシンリン酸化レベルの変化が関っていることが推察された。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1994 -1995 
    Author : KATADA Toshiaki; HOSHINO Shin-ichi; HAZEKI Osamu
     
    The human cell surface antigen CD38, which has an amino acid sequence homologous to Aplysia ADP-ribosyl cyclase, is a single-transmembrane type II glycoprotein. CD38 catalyzes not only the hydrolysis of NAD^+, but also the formation and hydrolysis of cyclic adenosine diphosphoribose (cADPR), which is a novel candidate that mediates Ca^<2+> release from intracellular Ca^<2+> stores. An increase in the cellular cADPR content was suggested in various types of cells by bioassays of a Ca^<2+>-releasing activity and/or the measurement of its amount on column chromatography. However, these assays are not sufficient for precise determination of the cellular cADPR content in terms of specificity and sensitivity. In the present study, we first developed a radioimmunoassay (RIA) for the measurement of the cellular cADPR content. The present RIA method, which exhibits reasonable specificity for and sensitivity to cADPR with prior treatment of the sample with enzymes, was applied to studies on the possible involvement of CD38 in the formation of cellular cADPR.1.Aplysia ADP-ribosyl cyclase was categorized as a lyase rather than hydrolase. 2.The CD38 NADase activity was, but the ADP-ribosyl cyclase activity was not, inhibited by dithiothreitol. These results indicated that enzyme reactions catalyzed by the two enzymes were different from each other, though both cleaved the N-glycoside bond of NAD^+ resulting in the liberation of nicotinamide. 3.However, Zn^<2+> directly interacted with CD38 to convert its catalytic properties from NADase to ADP-ribosyl cyclase, probably due to prevention of the access of water molecule to an intermediate of the enzyme-substrate complex. 4.A marked increase in cellular cADPR was accompanied by retinoic acid-induced differentiation of HL-60 cells. 5.Moreover, a high level of cellular cADPR was observed in other leukemic cell lines, in which CD38 mRNA was expressed. Thus, CD38, which was initially identified as an NADase, appeared to be responsible for the formation of cellular cADPR.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1994 -1995 
    Author : KATADA Toshiaki; HOSHINO Shin-ichi; HAZEKI Osamu
     
    The human cell surface antigen CD38, which has an amino acid sequence homologous to Aplysia ADP-ribosyl cyclase, is a 46-kDa type II glycoprotein with a single-transmembrane domain. We previously demonstrated that the extracellular domain of CD38 exhibits NAD^+ glycohydrolase (NADase) activity and that the ecto-form NADase activity induced by all-trans retinoic acid (RA) in HL-60 cells is due to CD38 (Kontani, K.et al., J.Biol.Chem.268 : 16895,1993). CD38 catalyzes not only the hydrolysis of NAD^+, but also the formation and hydrolysis of cyclic ADP-ribose, which is a novel candidate that mediates Ca^<2+> release from intracellular Ca^<2+> stores. In the present study, we obtained the following findings. 1. Besides these enzyme activities, CD38 had the ability to bind hyaluronate. 2. Stimulation of RA-differentiated HL-60 cells with anti-CD38 monoclonal antibody (mAb) induced rapid tyrosine phosphorylation of cellular proteins with the molecular weight of 120,000,87,000 and 77,000. One of the prominent phosphorylated proteins was identified as the c-cbl proto-oncogene product, p120^.3. Superoxide formation in response to formyl-Met-Leu-Phe was markedly enhanced by the anti-CD38 mAb in the differentiated HL-60 cells. 4. Zn^<2+> directly interacted with CD38 to convert its catalytic properties from NADase to ADP-ribosyl cyclase, probably due to prevention of the access of water molecule to an intermediate of the enzyme-substrate complex. 5. Although the expression of CD38 mRNA was mediated through nuclear RA receptors, a negative regulatory element present in the first intron of CD38 gene appeared to be involved in the RA-induced expression of CD38 mRNA in HL-60 cells.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1993 -1994 
    Author : KATADA Toshiaki; ISHIKAWA Yoshihiro; KURACHI Yoshihisa; HOSHINO Shin-ichi; HAZEKI Osamu
     
    GTP-binding protein (G proteins) consisting of alpha, beta, gamma subunits, carry signals from agonist-bound receptors to effectors such as enzymes or ion channels. Since the functions of G proteins as the signal transducers are profoundly affected by cholera or pertussis toxin which transfers the ADP-ribosyl moiety of NAD^+ to the alpha subunits of G proteins, the toxin-catalyzed ADP-ribosylation has widely been used as a tool to study the roles of G proteins in signal transduction processes. In the present studies, we investigated mechanisms by which the activities of an inwardly rectifying K^+ channel and adenylyl cyclase are regulated by the subunits of G proteins. 1) Activation of inwardly rectifying K^+ channels by the betagamma subunits of G proteins. An inwardly rectifying K^+ channel in guinea pig cardiac atrial cells is activated by the stimulation of muscarinic cholinergic or A^1-purinergic receptors in a manner sensitive to pertussis toxin. In inside-out patches of the cell membranes, the betagamma subunits of G proteins activated the K^+ channels. Properties of the betagamma-induced activation of the K^+ channel appeared to be the same as those observed in GTP-dependent receptor-mediated activation of the K^+ channel. Moreover, the receptor-mediated activation of the K^+ channel was selectively inhibited by GDP-bound from of G_t (transducin). These results indicate that activation of inwardly rectifying K^+ channel coupling to membrane-bound receptors is mediated through the action] of betagammasubunits resolved from alphabetagammatrimer. 2) Activation of adenylyl cyclase by protein kinase C.Cyclic AMP formation within cells is altered upon the activation of protein kinase C.However, the site (s) to be modified by the kinase in the cyclic AMP formation pathway remains unclear. Thus, effects of protein kinase C on the activity of adenylyl cyclase were investigated with purified proteins. Protein kinase C could phosphorylate adenylyl cyclase type V directly, leading to a 20-fold increase in its catalytic activity. This activation was much larger than that stimulated by forskolin (5 fold). When forskolin and the protein phosphorylation were combined, the type 5 cyclase activity was increased more than 100 fold over the basal. Thus, it appears that protein kinase C directly and potently activates adenylyl cyclase.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1992 -1994 
    Author : UI Michio; HAZEKI Kaoru
     
    Most parts of the present research depend on two experimental systems : i.e., primary cultured rat hepatocytes and phagocytes from guinea pig peritoneal fluids or cultured cell lines. The adult liver cells retained their differentiated liver functions during primary culture at the high-cell densities, whereas they entered the cell cycle or underwent proliferation exhibiting active DNA systhesis when cultured at the low-cell densities. As regards adrenergic receptor subtypes, the alpha_1-receptor-mediated signal was one of the differentiated liver functions ; beta_2-receptor-mediated cell responses developed quickly, at the expense of alpha_1-receptor-mediated ones, upon the G_0-to-G_1/S phase transition in the cell cycle. The development of beta_2-responses was inhibited by addition of the cell membrane fraction into the low-cell density culture, indicating essential roles of the cell adhesion via cell surface glycoproteins. Activation of glycogen phosphorylase, the eventual cell response to either alpha_1-or beta_2-receptor stimulation, was never inhibited by wortmannin, a selective inhibitor of phosphatidylinositol (PI) 3-kinase, when the latter subtype receptors were stimulated. In contrast, wortmannin was partially inhibitory to the cell response to alpha_1-receptor stimulation, being suggestive of occurrence of dual signaling systems, PI 3-kinase-dependent and -independent, in alpha_1-receptor initated Ca^<2+> signaling. In the case of phagocytes whose major functions inclde chemotaxis via cell-to-cell adhesion, we found, taking advantage of wortmannin again, PI 3-kinase to play an essential role in Fcgamma receptor-initiated signalng that is characterized by predominance of protein tyrosine kinase systems. A proten with a molcular weight of 115 kDa, tyrosine-phosphorylated upon the receptor stimulation, bound to the p85-regulatory subunit of PI 3-kinase, probably as a physiological activator of PI 3-kinase inphagocytes. This novel finding will afford an important problem to be solved in future studies. Stimulation of CR3, a complement receptor coupled to a pertussis toxin-susceptible heterotrimeric G protein, or concanavalin A receptors, consisting of the two types of G protein-coupled and non-coupled ones, gave rise to phagocytosis in a wortmannin-sensitive manner, providing evidence for involvement of PI 3-kinase in these signaling systems, too.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1992 -1993 
    Author : KATADA Toshiaki; NISHINA Hiroshi; TAKAHASHI Katsunobu; HOSHINO Shin-ichi; HAZEKI Osamu
     
    GTP-binding proteins consisting of alpha-, beta- and gamma-subunits (G proteins) carry signals from membrane receptors to effectors such as enzymes or ion channels. Recent studies have indicated that several peptides, such as mastoparan, directly interact with G proteins resulting in the activation of the signal-coupling proteins in manners similar to receptors stimulated by agonists. In the present studies, possible interactions of various venom peptides (and related compounds) with G proteins and/or membrane receptors were studied in reconstituted phospholipid vesicles. Mast cell-degranulating (MCD) peptide stimulated the steady-state rate of GTP hydrolysis catalyzed by the reconstituted G proteins. Synthetic D-MCD peptide, the optical isomer of MCD peptide, was also effective in the activation of G proteins as L-MCD peptide. The stimulations by L- and D-peptides were both abolished in G proteins that had been ADP-ribosylated by pertussis toxin. In comparison of the amino acid sequences of various peptides tested, the extent of the activation of G proteins appeared to be correlated with the number of basic amino acid residues in the alpha-helix of peptides. These results suggest that cationic clusters at one side of the alpha-helical surface are more important in the direct activation of G proteins than a specific, alpha-helical structure. Moreover, mastoparan induced conversion of a high- and a low-affinity states of membrane receptors for agonists to a new middle-affinity state, which was resulted from coupling of the receptors with G proteins. Thus, the various activities G proteins appeared to be utilizable for elucidation of some types of drug screening.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1992 -1993 
    Author : KATADA Toshiaki; NISHINA Hiroshi; TAKAHASHI Katsunobu; HOSHINO Shin-ichi; HAZEKI Osamu
     
    GTP-binding proteins (G proteins) consisting of alpha, beta and gamma subunits carry signals from membrane receptors to effectors such as enzymes or ion channels. The betagamma subunits initially appeared to be functionally interchangeable with different alpha subunits and to act merely as a regulatory component for the alpha subunits which regulated the activities of appropriate effectors. However, recent studies have revealed that betagamma subunits dissociated from G protein trimers are also capable of directly regulating the activity of various effectors, such as adenylyl cyclase, K^+ channel, and phospholipase C.Moreover, the betagamma subunits appear to interact with cytoplasmic proteins such as phosducin and beta-adrenergic receptor kinase other than receptors or effectors. In the present studies, we purified the betagamma subunits of G proteins from bovine brain membranes and found that there were chromatographically multiple forms of betagamma subunits which could be reassociated with various alpha-subunits. We also investigated cytosolic proteins that might interact with the betagamma subunits by means of betagamma subunit-immobilized affinity-column chromatography (betagamma-immobilized column). One of proteins purified through the beta-immobilized column had molecular weight of 93,000. The 93-kDa betagamma-binding protein appeared to be present in many tissues and identified as heat shock protein, hsp90. The hsp90 inhibited beta-supported pertussis toxin-catalyzed ADP-ribosylation of alpha subunits. The hsp90 was also capable of binding to betagamma subunits which had been reconstituted into phospholipid vesicles. The binding of hsp90 to betagamma subunits was inhibited by the addition of GDP-bound alpha subunits, but not by GTPgammaS-bound ones. These results suggested that hsp90 could associate functionally with free betagamma subunits dissociated from trimeric G proteins.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1992 -1992 
    Author : 宇井 理生; 星野 真一; 榎本 武美
     
    (I)副腎皮質や卵巣の腫瘍においてGi2αの変異が報告されている179番ArgをCysに置換した変異体を作製し、Arg残基の変異がGi2蛋白質の機能に及ぼす影響について検討した。組み換え体蛋白質は大腸菌を用いて大量に調製した。その結果、IAPによるADP-リボシル化の基質活性は、正常Gi2α(WT)と変異型Gi2α(R179C)で全く違いはみられなかったが、GTP水解速度(turnover number)が著しく低下していることが明らかになった。このような見かけの水解速度低下の原因としては、(I)Gi2αが本来有しているGTP水解活性(Kcat)の低下と(2)Gi2αが本来有しているGTPの解離速度の低下の二つが考えられるが、R179Cでは両者が共に低下し、特にkcat自体が著しく(2ケタ以上)低下していることが証明された。βγサブユニットとの会合に関しては、R179Cとの間に顕著な差は見られなかった。また、R179Cにおいて受容体との共役能が消失するようなことはなかった。このように、Gi2αの179番Argの変異は、主としてGTP水解活性の著しい低下を引き起こし、Gi2αが常に活性型(GTP結合型)に保たれていることが、腫瘍化に至るメカニズムのひとつとして重要な位置を占めるものと考えられた。 (II)Gi2蛋白質の発現量と癌転移との相関が示されているメラノーマ細胞において、G蛋白質遺伝子の発現を制御する転写因子とその結合DNA領域を検索する目的から、Balb/cマウス遺伝子ライブラリーよりGi2α遺伝子のクローニングを行った。その結果、単離した遺伝子の5^1非翻訳領域約600bpの塩基配列を決定し、4つのGCboxと2つのCAATboxの存在を明らかにした。また、AP2結合部位のコンセンサヌ配列も存在することから、cAMPやCキナーゼ系を介する発現制御機構の存在が示唆された。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1991 -1992 
    Author : OKADA Fumihiko; HOSHINO Shinichi; UENO Takeharu; TOKUMITSU Yukiko
     
    Concentrations of the alpha subunits of GTP-binding protein, Go (Goalpha) and of Gi2 (Gi2alpha) in 6 areas of control and schizophrenic post-mortem brains were investigated using the highly sensitive enzyme immunoassay method. There was a significant decrease in Goalpha in the hippocampus of the right hemisphere in schizophrenic patients compared to controls; SAS analysis demonstrated a significant diagnosis x side interaction. In other areas of the brain, analysis by grouping under diagnosis, side, age, gender and postmortem delay showed no significant deviations in Goalpha between controls and schizophrenics. The concentrations of Gi2alpha did not differ significantly in any area. These findings contrasted with the results yielded by ADP-ribosylation, which showed decreased pertussis toxin ADP-ribosylated amounts in the hippocampus and putamen of the contralateral (left) hemisphere. The discrepancy might be explained by the existence of differing conformations of Go or Gi1 in the hippocampi of the right and left sides in schizophrenics.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1990 -1990 
    Author : 星野 真一
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1990 -1990 
    Author : 岡田 文彦; 星野 真一; 上野 武治; 徳光 幸子
     
    左側の側脳室下角の拡大を確認した精神分裂病剖検脳と年令,性を一致させた対照群の剖検脳を用いて,各々9の脳部位について,百日咳トキシンによるADPリボシル化反応を行い,G/Go量を測定した。さらにそのうちの各々6部位についてエンザイム・イムノアッセイ法により,GoαとGi2αを測定した。精神分裂病群では左側の側頭下角壁を構成する海馬でGi/Go量が低下していた。右側の海馬では対照群との間に有意差は認められなかった。左側の被殻でもGi/Go量が低下していた。右被殻では有意差は認められなかった。その他の脳部位では同様の有意差を認めなかった。この被殻でのGi/Go量の低下はド-パミンーD_1ーアデニレ-トシクラ-ゼ系活性の亢進を示す所見かもしれない。すなわち.線状体におけるD_1ーGsーAC系とD_2ーGiーAC系のバランスの崩壊が精神分裂病の病状発症と深く関連している可能性が考えられる。左海馬でのGi/Go量の低下は同部位でのGABAーB,5HTlAなどの受容体と百日咳感受性G蛋白とが共役していることから,この系の障害が精神分裂病の病態と関連することも考えられた。さらに,エンザイム・イム/アッセイ法により測定したGoαの値は前頭眼景面でのみ精神分裂病群で低下していた。その他の脳部位では有意差を認めなかった。Gi/Go量で認められた左海馬と左被殻での低下はもっぱらGi(Gilα)の低下によると考えられた。従来より精神分裂病では前頭部のhypofrontalityが存在する可能性が指摘されており,本研究の所見はそれを支持すると考えられた。Gi2αは組織による濃度差が少なく,遺伝子的にはGi2αmRNAはハウスキ-ピング遺伝子であると推定されているが,本研究でも,各脳部位とも有意差のある所見は認められなかった。

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