MF Researcher Database

Researchers Database

Advance

KUME Kazuhiko

    Graduate School of Pharmaceutical Sciences Department of Neuropharmacology　Professor
Last Updated :2025/04/29

Researcher Information

URL

J-Global ID

Research Interests

  • 統合脳・分子脳科学   包括脳ネットワーク   ロイコトリエン   Src型チロシンキナ-ゼ   有機アニオン   ニュ-ロン   三量体Gタンパク質   発現制御   発現誘導   リン酸化   Hck   遊走   LTB_4受容体   心筋細胞   pdx 1   G蛋白質   プロモ-タ-解析   ケラチノサイト   c粒物Srcキナ-ゼ   貪食   ドーバミン   CsK   Lun   増殖因子   標的遺伝子組み換え   LTD_4受容体   胆汁排泄   顆粒分泌   pdx1   遺伝子クロ-ニング   Lyn   ロイコトリエン受容体   試験管内分化誘導   Fyn   再生医学   β細胞   膵臓   ドーパミン   Fe受容体   エンドトキシンショック   メラノサイト   色素沈着   細胞内情報伝達   内胚葉誘導   胚性幹細胞   貧食   ノックアウトマウス   c-Src   ショウジョウバエ   生物時計   概日周期   寿命   MAPキナ-ゼ   脱感作   不眠   睡眠   時間生物学   トランスジェニックマウス   PAF   受容体   PAF受容体   血小板活性化因子   

Research Areas

  • Life sciences / Pharmacology
  • Life sciences / Pharmaceuticals - health and biochemistry
  • Life sciences / Neuroscience - general
  • Life sciences / Functional biochemistry
  • Life sciences / Medical biochemistry

Academic & Professional Experience

  • 2013/04 - Today  Nagoya City University, Gradate School fo Pharmaceutical SciencesProfessor
  • 2002/03 - 2013/03  Kumamoto UniversityInstitute of Molecular Embryology and Genetics准教授（←助教授）
  • 1997/04 - 2002/03  The University of Tokyo, Graduate School of Medicine助手
  • 1992/06 - 2002/03  東京大学 医学部（医）生化学教室助手
  • 2000/01 - 2002/02  Tufts University, School of MedicineVisting Scientist
  • 1999/02 - 2000/01  Harvard UniversityVisting Scientist

Published Papers

MISC

Research Grants & Projects

  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2024/04 -2028/03 
    Author : 大澤 匡弘; 太田 淳; 粂 和彦; 小山内 実; 竹内 雄一
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2024/04 -2028/03 
    Author : 岩田 宏満; 柴田 泰宏; 加藤 洋一; 鵜川 眞也; 粂 和彦; 歳藤 利行; 冨田 淳; 嶋田 逸誠; 荻野 浩幸; 平山 亮一
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2024/04 -2027/03 
    Author : 粂 和彦; 冨田 淳; 鈴木 力憲
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2021/04 -2024/03 
    Author : 粂 和彦; 冨田 淳
     
    睡眠は、身近な現象だが、現在でも謎が多い。本研究課題は、種を超えて進化的に保存されている睡眠という生命現象の制御機構と生理的意義の解明を目指して、研究代表者が20年前からパイオニアとして世界をリードしてきたショウジョウバエをモデル生物とする睡眠研究を継続的に発展させるものである。ショウジョウバエは、100年以上にわたり遺伝学のモデル生物して使われ、概日周期行動の分子機構の解明などに用いられるが、睡眠の制御遺伝子も哺乳類と共通するものが多い。今期の研究では、[1]覚醒の制御回路、[2]覚醒と概日周期との関係、[3]覚醒と睡眠の恒常性の関係に焦点をあてた研究を進めている。2021年度は、新規課題の初年度で、前期から継続して発展させた研究の成果を、以下の内容の4報の論文として発表した。１．睡眠制御機構について、各種のアミノ酸が睡眠に与える影響を網羅的に解析した結果、D-セリンという稀少なアミノ酸が睡眠制御に働く可能性を示した。２．新規受容体遺伝子の解析から、哺乳類のノルアドレナリンという覚醒物質に相当するオクトパミンの覚醒制御における役割を解明した。３．代謝と睡眠をつなぐ物質として、インスリン様ペプチドが時計神経で睡眠を制御することを明らかにした。４．ドーパミン神経のサブセットの一つが、覚醒を制御する新規の神経回路を解明した。また、今期の研究課題の中心テーマの一つである睡眠恒常性について、睡眠量を制御する遺伝子の候補として、哺乳類で睡眠欲求指標リン酸化タンパク質として発見された遺伝子群を機能スクリーニングして、睡眠制御に関与する遺伝子の候補を少なくとも5つ発見して解析を進めている。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2018/04 -2021/03 
    Author : Kume Kazuhiko
     
    In this study, we conducted sleep studies in Drosophila. We identified the complete circuit of the T1 dopaminergic neuron, which controls sleep-wake, through multiple neurons of the central complex in the brain. We also found that the SIK3 gene, which regulates sleep in mice, regulates sleep in Drosophila functioning in a clock neurons that controls the circadian rhythm. These results indicate that the circadian rhythm and sleep homeostasis mechanisms, which have been thought to be independently regulated, may have a close mutual interrelationship. We found that some genes whose phosphorylation levels correlate with sleep demand in mice are also involved in sleep regulation in Drosophila, and that phosphorylation levels also change in Drosophila, indicating a similarity across species.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2016/04 -2019/03 
    Author : Masahiro Ohsawa
     
    Pain is a sensory stimulus that felt with negative emotions. In addition, the mind status affects pain sensitivity. In this study, we indicated that the brain neural network circuit involved in unpleasant emotions is activated under chronic pain condition using quantitative activation-induced manganese-enhanced magnetic resonance imaging. In addition, even minor stimuli are recognized as pain in the animal with negative emotion (depression). In particular, when the activity of the brain region related to negative emotion, such as anterior cingulate cortex is increased, these animals becomes hypersensitive to pain. From these results, it is possible to suggest that approach from emotional aspect is considered effective to treat intractable pain.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2013/06 -2018/03 
    Author : SAITOE Minoru
     
    Taking advantages of Drosophila, we discovered how dopaminergic neurons reinforce association of sensory information to produce associative memory and identified novel mode of dopamine release induced by activity of postsynaptic neurons. Regarding consolidation of labile short-term memory to stable long-term memory, we found that c-fos/CREB transcriptional cycling formed by MAPK, which is activated during resting intervals of spaced training, encodes long-term memory in memory engram neurons, and identified a novel neuron-glia interaction by which glial cells express genes required for long-term memory formation. We also identified novel transcriptional machineries required for maintenance of long-term memory. Regarding alternation of memory mechanism upon aging, we found that age-related increase in activity of pyruvate carboxylase attenuates production D-serine in glial cells thereby impairs middle-term memory in aged flies.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2014/04 -2017/03 
    Author : Ida Takanori; Mamiko Ozaki; Kume Kazuhiko; Hatsumi Tominaga; Eri iWamoto
     
    The purpose of this research is hunting of novel bioactive peptides and elucidation of physiological role of these peptides in arthropod. Especially, I try to elucidate the feeding behavior for these peptides, and aim at disinfestation of a harmful insect and efficient upbringing of the useful arthropod. As a result, we found five novel bioactive peptides for drosophila orphan receptors. We clarified CCHamide secreted from fat body affected to insulin producing cell in the brain, and modulated secretion of insulin-like peptide, then controlled growth. In addition, we clarified dRYamide had strong anorexigenic activity in fly and prawn. These functions are looking for a possibility to the industrial application.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2013/04 -2016/03 
    Author : KUME KAZUHIKO
     
    We analyzed the sleep-arousal mechanism of a fruit fly, Drosophila melanogaster, which has been noted as a model for sleep study. First, we identified NMDA glutamate receptor as a novel sleep regulating gene. This provides a clue to the relationship between sleep and memory. Next we found that artificial sweeteners, but not non-sweet nutritive saccharides, induced sleep in fasting flies. Activation of sweet-receptor expressing neurons also induced sleep. Arousal threshold, however, was not reversed in artificial sweetener-fed flies. These results suggests that sweetness facilitates the transition from arousal to sleep, while the nutritional state, i.e. satiety inhibits that from sleep to arousal. In addition, we found glycine induces sleep in flies similarly in mammals, re-confirming that fruit fly can serve as a good model animal for sleep study.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2010 -2012 
    Author : KUME Kazuhiko
     
    Using Drosophila melanogaster as a model animal for sleep research,we identified calcineurin and others as novel sleep related genes and showed therelationship between sleep and memory retention. By the analysis of dopamine functions,which is an arousal regulator, we showed its role in rest length regulation, metabolismand temperature preference. We also identified arousal regulating dopamine circuit infly brain at the single cell level.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2008 -2010 
    Author : TAKAHASHI Takao; TANAKA Tomohiro; YAHATA Hideyuki; TAGUCHI Hiroaki; ASAI Atsushi; ITAI Koichiro; KITAMURA Toshinori; MATSUDA Ichiro; MORITA Toshiko; INABA KAZUTO; TOBIASU Baua; ISOBE Tatsu; DARILU Meisa; KUME Kazuhiko; KODAMA Masayuki; MAEDA Hitomi; KITAMURA Satoko
     
    We analyzed bioethical arguments in Japan through various areas such as end-of life care, reproductive medicine, medical genetics and based on three level analysis, i.e., the level of medical practices, concrete principles and ethical theories, and so we made clear the feature of bioethics in Japan, such as bottom up character. Also we found out, by reexamining the relationships among three levels, that so called bioethical principles are universal because they are abstracted from various practices, and that the first level and the third level are closely connected with each other.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2005 -2006 
    Author : KUME Kazuhiko
     
    Sleep is a physiological brain function observed in broad animal species including fruit fly, Drosophila melanogaster. Recent progress in molecular analysis of sleep and arousal regulations in Drosophila validated the homology between insect and mammals. We identified a spontaneous Drosophila mutant with a hyperactive, sleepless activity pattern and named it fumin. We then identified this phenotype was caused by the mutation in the dopamine transporter gene using forward genetics approach. A fragment of transposon was inserted into the intron, which deteriorates splicing and the resulting mRNA gives only a truncated protein presumably with no function. The dopamine transporter affected is found in mammalian brain and it is regarded as a target of psychostimulants such as amphetamine and cocaine. This result suggested that the arousal mechanisms of Drosophila and mammals share common molecules and genes. We then analyzed the phenotypes of fumin more in detail. Two major findings were established during this project. First, the longetivity of fumin is equivalent to the wild type control despite they show 3 to 4 fold increase in total activity and one third to one fourth decrease in total sleep amount. However, when fumin mutants were fed with high calorie diet, they gradually increase their activities and they show shorter life span than the wild type. This result suggested that there is a minimal requirement period of sleep in Drosophila. Second, we applied fumin mutant caffeine, which is an arousal inducing agent commonly used by human. Surprisingly, fumin was more sensitive to caffeine than wild type, and they show dramatically increased activity and decreased sleep. Moreover, caffeine was more toxic to fumin, and with the dose which is not toxic to wild type, fumin mutant die quickly. This result also suggested that there is a minimal requirement of sleep in Drosophila.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2005 -2005 
    Author : 粂 和彦
     
    われわれは、ショウジョウバエを用いて、概日周期・覚醒睡眠制御機構の解析を行っている。特に、われわれが樹立した、睡眠の量が減少したショウジョウバエの変異株、fumin(不眠、fmn)は、遺伝学的マッピングと、cDNA・ゲノムの配列決定により、ドーパミン・トランスポーター遺伝子の機能欠失変異であることが示されている(K.Kume et al. J. Neurosci.25:7377-7384,2005)。この変異株の解析から、ドーパミンは、ショウジョウバエが不動状態にある時の反応性そのものに関係していることを薬理学的な実験などで、確認中している。また、ショウジョウバエの概日周期の中枢は、脳の中の限られた数のニューロンであることが知られており、その多くがPDF (Pigment dispersing factor)というペプチドを産生するPDFニューロンである。 そこで、ショウジョウバエの睡眠覚醒と概日周期の関係を調べるため、このPDFニューロンと、ドーパミンニューロンのそれぞれが蛍光蛋白質(GFP)でラベルされるショウジョウバエの系統を作成し、その脳を単離し、in vitroで培養する系を樹立した。 従来、単離した昆虫の神経細胞は、不安定で長期培養は困難とされていたため、培養液の改良などにより、長期培養条件の検討を行った。その結果、マウスの初期培養で用いられている、マウス胎児脳の初期培養細胞の培養上清を加えることで、1週間以上の長期にわたって安定して初代培養できる条件が確立できた。この系では、単離した神経細胞が、神経突起を伸長できることまで確認している。現在、電気生理学的・分子生物学的性質を、解析中である。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 2003 -2004 
    Author : KUME Kazuhiko; KUME Shoen
     
    Physiologically, sleep is defined by electroencephalography, and typical REM and NREM sleep occur only in mammalian and avian species. But sleep-like inactive states also appear in other vertebrates and even in invertebrates. Similar to mammalian sleep, the inactive 'rest' state of insect is regulated by both circadian and homeostatic processes, which were demonstrated first in the cockroach 1, then in the fruit fly, Drosophila melanogaster. However, the similarity is based primarily on behavioral criteria. In the course of analyzing the nature of sleep-like rest behavior in Drosophila, we discovered by serendipity hyperactive sleepless mutant flies and named them fumin (fmn), which means 'sleepless' in Japanese. We then determined the nature of the mutation by forward genetics. To our surprise, we found that their behavioral phenotype is due to a genetic lesion in the dopamine transporter (DAT) gene. The elimination of DAT activity generates a continuous wakefulness in mutant flies, resulting in dramatically increased activity levels. finn mutants are more sensitive to mechanical stimuli when they are in prolonged immobility, indicating their decreased arousal threshold. They also show attenuations in rest (sleep) rebound. Mammalian DAT is a well-known target of psychostimulants, such as amphetamine and cocaine, and involved in wakefulness regulations. These results indicate a critical role of dopamine for arousal state in Drosophila and highlight a similarity between insects and mammals regarding the molecular basis of arousal. The use of a Drosophila model is expected to facilitate an understanding of arousal regulations.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2003 -2004 
    Author : 粂 昭苑; 粂 和彦
     
    我々は、膵への発生分化の機序を明らかにするために、ES細胞を用いて、膵臓への分化過程を再現出来る実験系を構築している。これまでに、膵幹細胞のマーカーであるpdx-1遺伝子発現を容易に検出可能のために、pdx1遺伝子座にlacZレポーター遺伝子をノックインしたES細胞を用いてきた。その結果、(i)膵臓原基とEs細胞との共培養、(ii)TGF-β2の添加、(iii)Es細胞への内胚葉誘導因子c-mix遺伝子の強制発現、によっでES細胞から膵への分化誘導が促進されることを明らかにした。 さらに、ES細胞由来の膵幹細胞をリアルタイムで追跡し、生きた細胞を純化するために、pdx-1遺伝子の発現をGFP(緑色蛍光タンパク質)で可視化した。まず、pdx-1-GFPトランスジェニックマウス(Gu et al.,2002)より、ES細胞株を樹立した。トランスジェニックマウスにおいては、pdx-1遺伝子が膵臓幹細胞で特異的に発現されることがすでに確認されているので、樹立したES細胞から分化したGFP陽性細胞は膵に特異性があると考えられた。このES細胞株から、効率よくES細胞から膵へ分化が誘導されることが確認された。ES細胞から誘導されたpdx-1/GFP陽性細胞をセルソーターを用いて、GFP陽性細胞の蛍光強度に基づき分画した。RT-PCR法により解析した結果、GFP陽性分画にpdx-1陽性細胞が濃縮されていることが分かった。このES細胞由来のpdx-1陽性細胞について、遺伝子発現網羅的解析を行なった。我々の系で得られた膵幹細胞の遺伝子プロファイルと、既に報告されているマウス胎生7.5日目の正常内胚葉層及び膵幹細胞の遺伝子発現プロファイル(Gu et al.,2003)と比較した結果、マウス胎生7.5日目の内胚葉で発現する遺伝子プロファイルとよく似ているプロファイルであることが明らかとなった。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 2003 -2003 
    Author : 粂 昭苑; 粂 和彦
     
    申請者らが構築したES細胞から膵への分化誘導系において、アフリカツメガエルのmixファミリーのニワトリホモログであるc-mix遺伝子を強制発現させた結果、膵への分化誘導能が促進されたことを見い出している。このc-mix遺伝子強制発現ES細胞株と、対照株との遺伝子発現プロファイリング解析を行い、内胚葉誘導に関与する遺伝子群の同定出来ると考えられた。本研究ではDNAチップを用いた遺伝子解析を行なうと共に、rt-pcr法により、遺伝子導入株では内胚葉分化マーカーの発現が上昇していることを示した。今後はここで絞られた候補について、さらにアフリカツメガエル初期胚で強制発現させ、内胚葉誘導活性についてスクリーニングを続ける予定である。 さらに、pdx-1-GFPトランスジェニックマウスより、ES細胞を樹立し、生きた状態でpdx-1の遺伝子発現を追跡可能の系を確立した。また、申請者らはこれまでに、ES細胞からの膵への分化誘導を支持する細胞を複数同定してきた。これら支持細胞を用いて、ES細胞から膵へ効率良く分化誘導された。さらに、ES細胞からの分化誘導の条件を無血清条件でアッセイできる系を確立し、TGFβ2を添加することにより、顕著な膵分化誘導を認めた。このように、これまでに確立した実験系では、充分に効率よくES細胞から膵へ分化を誘導することができたので、ES由来の膵幹細胞を今後セルソーターを用いて純化し、遺伝子発現プロファイリングなどによる細胞生化学的解析を進めようと考えている。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1998 -2001 
    Author : 和泉 孝志; 粂 和彦; 清水 孝雄; 大日方 英; 魚住 尚紀; 和泉 孝志
     
    本年度の研究成果は以下の通りである。 1.細胞質型PLA2(cPLA2)欠損マウスの表現型の解析に関する研究 cPLA2欠損マウスの表現型の解析を、成人呼吸窮迫症候群および大腸ポリポーシスについて行ってきたが、現在、脳虚血後再灌流傷害、ブレオマイシン気道投与による急性肺炎、コラーゲン惹起関節炎、アレルギー性脊髄炎などの疾患モデルの解析が進んでおり、いずれも本マウスにおいて症状が軽減していることを確認している。 2.新規PLA2に関する研究 カイニン酸によって痙攣発作を誘発したマウスやラットにおいて、海馬歯状回に時期特異的に発現するcPLA2遺伝子由来の新規蛋白質を発見し、そのプロモータ領域の解析を行っている。この新規蛋白質を発現する細胞が未分化の神経細胞であることを確認した。 3.生理活性脂質産生制御に関する研究 cPLA2と同時にカルシウム刺激に応じて核膜に移行してロイコトリエン産生に関与する5-リポキシゲナーゼの、細胞内局在と移行の分子機構に関する研究を行い、核移行シグナルと核外移行シグナルに依存した機構が存在することを明らかにした。 4.生理活性脂質受容体に関する研究 血小板活性化因子(PAF)受容体を介するPAFの分解を報告した。第2LTB4受容体のリガンドの性質について報告した。さらに、ペプチド性ロイコトリエン受容体のマウスにおける発現を解析し、種差や系統差による生理活性脂質の作用の差について考察を加えた。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1999 -2000 
    Author : HONDA Zenichire; YOKOMIZO Takehiko; KAZUHIKE Kume
     
    Initial biochemical signaling originating from high-affinity immunoglobulin E receptor (FcεRI) has been ascribed to Src family kinases. To understand the mechanisms by which individual kinases drive the signaling, we conducted reconstitution experiments : FcεRI signaling in RBL2H3 cells was first suppressed by a membrane-anchored, gain-of-function C-terminal Src kinase and then reconstructed with Src family kinases whose C-terminal negative regulatory sequence was replaced with a-myc epitope. Those constructs derived from Lyn and Fyn, which are associated with detergent-resistant membranes (DRMs), physically interacted with resting FcεRI and reconstructed clustering-induced signaling that leads to calcium mobilization and ERK1 and-2 activation. c-Src-derived construct, which was excluded from DRMs, failed to interact with FcεRI and to restore the signaling, whereas creation of palmitoylatable Cys3 enabled it to interact with DRMs and with FcεRI and to restore the signaling. Deletion of Src homology 3 (SH3) domain from the Lyn-derived construct did not alter its ability to transduce the series or signaling. Deletion of SH2 domain did not affect its association with DRMs and with FcεRI nor clustering-induced tyrosine phosphorylation of FcεRI β and γ subunits, but it almost abrogated the next step of tyrosine phosphorylation of syk and its recruitment to FcεRI.These findings suggest that Lyn and Fyn could, but c-Src could not, drive FcεRI signaling and that N-terminal palmitoylation and SH2 domain are required in sequence for the initial interaction with FcεRI and for the signal progression to the molecular assembly.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1998 -1999 
    Author : IZUMI Takashi; HOSHIKO Shigeru; KUME Kazuhiko; SHIMIZU Takao
     
    Lipid mediators such as leukotrienes (LTs) and platelet-activating factor (PAF) are major chemical mediators involved in inflammatory and allergic disorders. Despite their potent biological activities, little is known about the function and translational regulation of their receptors. To clarify these questions, we carried out following experiments and obtained some results that may contribute better understanding of patho-physiological roles of lipid mediators and development of new therapies and drugs for inflammatory and at11ergic disorders. 1. We analyzed the mechanisms of ligand-induced internalization of PAP receptors. 2. Using PAP receptor knockout mice and cPLA2 knockout mice, the roles of lipid mediators in acute lung injuries occurred by LPS and acid were investigated. 3. Functional coupling of LTB4 receptor with G-proteins in porcine WBC was identified. 4. Analysis of human genome for LTB4 receptor was carried out. The mechanisms for leukocyte specific expression of LTB4 receptor was clarified. 5. cDNA clones for LTB4 receptors of mouse, rat and Guinea pig were identified. And their functions were analyzed. 6. We analyzed the signal transduction mechanisms through LTD4 receptors using human monocytic leukemia THP-1 cells.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1998 -1999 
    Author : SHIMIZU Takao; TANIGUCHI Masahiko; IZUMI Takashi
     
    Neuronal survival and death are determined by multiple factors including neuronal activity as well as an influence from surrounding glia. In this project, we focus on various lipid mediators in terms of its ability of interaction between neuron and glia. We found that various lipid mediators are produced by stimuli, and play roles in the network as follows. LPA, produced by various cells, stimulates growth and cell maturation of neuron as well as proliferation of astrocytes. LPA also releases various cytokines and neurotrophis (NGF, BDNF) from astroglia, which activates neuronal cells. PAP is released from neuron by the NMDA stimulation, and acts on microglia. Microglia produces NO, and causes chemotaxis towards neuron, suggesting the role of microglia for repairing neuronal cells. PAF receptor-deficient mice and phospholipase A2 (cPLA2)-deficient mice are established, and their congenic mice are now available by backcrossing. The exact roles of these lipid mediators will be clarified by extensive analyses of their phenotypes.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1998 -1998 
    Author : 和泉 孝志; 粂 和彦; 清水 孝雄
     
    血小板活性化因子(PAF)はアレルギー反応、免疫反応などの主要なメディエーターの1つである。PAF受容体遺伝子はGタンパク質を介する7回膜貫通型の受容体であることが明らかにされたが、その構造と機能の関連や、疾患における役割については充分解明されてはいなかった。本研究では、1:PAF受容体遺伝子に変異を導入し哺乳動物細胞に発現させ、リガンド結合様式や解明や脱感作現象との関連を調べることにより、PAF受容体の構造と機能の関わりを検討すること、2:すでに確立しているPAF受容体トランスジェニックマウスとノックアウトマウスを用いて、疾患モデルにおける解析を行いこれらの病態におけるPAF受容体の果たす役割を検討することを目的とした。 PAF受容体のN末端に標識配列をつけ、リガンド刺激によるインターナリゼーションおよびリサイクリングを、標識配列に対する125I-標識2次抗体を用いた放射活性の測定、およびFITC標識2次抗体を用いた蛍光顕微鏡での観察により解析し、リガンド刺激によるPAF受容体の細胞内移行がクラスリン依存的であることを証明した。アゴニスト除去によりPAF受容体の再分布が観察されるが、このときPAF受容体は再感作されリガンドに対する応答性が回復していることが明らかにされた。 PAF受容体過剰発現マウス、PAF受容体欠損マウスおよびcPLA2欠損マウスを用いて生理活性脂質の成人呼吸窮迫症候群(ARDS)における役割を、塩酸の気道注入によるマウスモデルにおいて検討し、ARDSの発症にPAF受容体およびcPLA2が深く関与していることを示した。これは、PAFおよびアラキドン酸代謝物がこの疾患モデルにおける病態形成に重要な役割を果たしていることを示唆している。 本研究により、PAF受容体の構造と機能の解析が進み、さらに疾患モデルおける生理活性脂質の役割を明らかになったことにより、新たな治療法開発の可能性を示すことができた。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1997 -1998 
    Author : 粂 和彦
     
    血小板活性化因子(以下PAF)受容体を高発現するトランスジェニックマウスを樹立したところ、予想外の表現形として、色素沈着と表皮の肥厚、つまりメラノサイトとケラチノサイトとの増加が観察された。本研究では、この表現形を詳細に検討することにより、皮膚細胞におけるPAFの役割を調べた。 in situ hybridization法による導入遺伝子の発現検討から、ケラチノサイトにはPAF受容体遺伝子が多量に発現していたが、メラノサイトには発現が認められなかった。また、メラノサイトの増加の認められない背中の皮膚などでもケラチノサイトの増加は認められた。ケラチノサイトの分化のマーカーであるサイトケラチンK1及び、フィラグリンの免疫染色結果、及び、増殖細胞の比率を表すin vivoでのBrdU取り込み細胞の測定により、基底細胞の増殖が亢進して、表皮層が厚くなっているが、角化細胞への分化は、ほぼ正常に近く保たれていることが示された。そのため、PAFはケラチノサイトに対して増殖因子として働き表皮を肥厚させ、その結果、ケラチノサイト由来の何らかの増殖因子の影響で、メラノサイトの増殖が惹起されていると考えられた。さらに、PAFの拮抗剤を含む軟膏を、トランスジェニックマウスの片側の背中・耳の皮膚に塗布したところ、プラセボを塗布した側に比し有意にBrdUの取り込みが減少し、PAFが増殖作用を持っていることが強く示唆された。 以上のことより、培養線維芽細胞と同様にケラチノサイトに対しても、PAFが増殖の亢進作用を示すことが、トランスジェニックマウスを用いたin vivoの系でも示された。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1997 -1998 
    Author : HONDA Zenichiro; SHIMIZU Takao; KUME Kazuhiko; HIROSE Naoto
     
    We have analysed the mechanisms, from the view of the relevance of Src family kinases, of base inflemmetory processes of 1)Fc receptor-mediated ^-Ca^<++> inflax and degranulation 2)Fc receptor-mediated phagocytosis, and of 3)Integrin-mediated cell adhesion and locomotion. By using a model mact cell live, and a model macrophage line variously expressing Src family kinases, e-terminal Src kinases, and their mertated forms in various combinations, we have revealsd. 1)Fc-reeptor mediated Ca^<++> inflax and degranulation require Src family kinases. 2)Lyn, and Fyn can transmit the signal, but C-Be connot. 3)Both SH_4, and SH_2 domains of Lyn are required, but SH_3 domain is not required for the functions. 4)Fc-receptor mediated particle ingestion requires Src family kinases. 5)HCK and Lyn can catalyse the reaction, C-Snc cannot. 6)Integrin-mediated podosome formation of medicated both by Lynand C-Src. 7)Only Lyn catalyze Integrin-medicated chemotaxis.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1997 -1998 
    Author : IZUMI Takashi; KUME Kazuhiko; SHIMIZU Takao
     
    Leukotrienes are major lipid mediators involved in inflammatory and allergic disorders. Despite their potent biological activities, little is known about the receptors and intracellular signaling pathways. 1.We cloned a cDNA for a LTB_4 receptor (BLT) from HL-60 cells differentiated with retinoic acid using a subtraction strategy. The open reading frame (ORF) of the cDNA encodes a protein of 352 amino acids and is predicted to contain seven membrane-spanning domains. In CHO cells stably expressing BLT, LTB_4 elicited many signal transductions such as increase in intracellular calcium, InsP_3 accumulation, and inhibition of adenylyl cyclase. The CHO cells revealed a marked chemotactic response toward nM order of LTB_4. Calcium increase and InsP_3 accumulation induced by LTB_4 were partially sensitive to pertussis toxin (PTX), while chemotaxis and inhibition of adenylate cyclase were completely sensitive to PTX, indicating that BLT transduces LTB_4 signals through both PTX-sensitive and -insensitive G proteins. 2.We analyzed the signal transduction mechanisms through LTD_4 receptors using human monocytic leukemia THP-1 cells. When these cells were stimulated with LTD_4, intracellular calcium concentration was increased and mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) was activated. A chemotactic response of THP-1 cells toward LTD_4 was also observed. We found that LTD_4 has at least two distinct signaling pathways in THP-1 cells, a PTX-insensitive mitogen-activated protein kinase activation through protein kinase Calpha and Raf-1 and a PTX-sensitive chemotactic response. This cellular signaling can explain in part the versatile activities of LTD_4 in macrophages under inflammatory and allergic conditions.
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1997 -1998 
    Author : SUGIYAMA Yuichi; KUME Kazuhiko; ITO Kiyomi; KATO Yukio; SUZUKI Hiroshi
     
    Liver, along with kidney, plays an important role in the detoxification of xenobiotics. It is well established that drugs in the circulating blood are taken up into the liver via transporters on the basal membrane, and then excreted into the bile via transporters on the bile canalicular membrane. Concerning the transporters responsible for the uptake, Na^+-dependent bile acid transporter (Ntcp) and organic anion transporter 1 (oatp1) have been identified. However, no quantitative studies have been performed on the contribution of these transporters to the hepatic uptake of drugs. In the present study, we determined the contribution of each transporter in hepatic drug uptake, by comparing the ability to take up drugs into hepatocytes and into cDNA-transfected mammalian cells. The results suggested the presence of multiplicity for both Na^+-dependent and independent transport systems. Studies are under way to determine the contribution of homologous transporters (such as oatp2 and oat 3). Concerning the transport across the bile canalicular membrane, the transport properties of organic anions has been identified by using the isolated bile canalicular membrane vesicles isolated from rats and humans. In addition, we have characterized the transport properties of canalicular multispecific organic anion transporter (cMOAT) using the membrane vesicles isolated from cDNA-transfected cells. Moreover, as a homologue of cMOAT, we have cloned rat and human MRP3 (multidrug resistance associated protein 3). Studies with isolated membrane vesicles from mammalian cells transfected with MRP3 cDNA, it was demonstrated that MRP3 accepts glucuronides, but not glutathione-conjugates, as good substrates. Thus, the difference in the transport characteristics was demonstrated between MRP1/2 and 3. In rats and HepG2 cells in culture, MRP3 was induced by phenobarbital, suggesting that the difference in the expression level of MRP3 may result in the interindividual difference in the ability to excrete xenobiotics and/or their conjugates into the bile in humans.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1997 -1997 
    Author : 和泉 孝志; 粂 和彦; 清水 孝雄
     
    血小板活性化因子(PAF)は生理活性脂質の一つではアレルギー反応、免疫反応などの主要なメディエーターである。PAF受容体はGタンパク質を介する7回膜貫通型の受容体であり、複数のGタンパク質に共役して多彩な細胞内情報伝達機構を動かすことが明らかとなっている。PAF受容体の一次構造は決定されたが、リガンド結合部位、Gタンパク質との共役の機構、C末端に存在するリン酸化部位のはたしている役割などの構造と機能の関連についてはほとんど解明されていない。 今回我々はPAFの受容体への結合様式を探る目的で次の実験を行った。PAFは分子内にリン酸基の正電荷、コリンの負電荷をもっており、PAF受容体の膜貫通部位に存在する荷電をもつアミノ酸残基がその結合に関与している可能性が高い。そこで先ず、膜貫通部位に存在する荷電をもつ極性アミノ酸残基をアラニンに転換した変異体をCOS細胞に発現させ、アンタゴニストに対する結合能は変わらないがアゴニストに対する結合能が大きく変化する変異体(高親和性7個、低親和性7個)を得た。次に、代表的な3個ずつの高親和性(N100A,T101A,S104A)、低親和性(H188A,H248A,Q276A)の変異体をCHO細胞に安定的に発現させ、膜標品を用いた結合実験を行うと同時に、細胞内情報伝達系の解析を行った。高親和性の受容体はより低濃度のPAFにより情報を伝えることが明らかになった。その内の1つN100Aは通常は不活性なPAFの前駆体であるlyso-PAFに対しても反応するようになっていた。これらの実験の結果と3次元立体モデルの解析により、PAFの受容体への結合部位は膜貫通部位であり、グリセロール骨格のC1にエーテル結合するアルキル基は深く膜貫通ドメインに挿入され疎水性アミノ酸残基と疎水性結合を行い、リン酸基の正電荷、コリンの負電荷は膜貫通部位の荷電を持ったアミノ酸残基とイオン結合する可能性が示された。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1996 -1997 
    Author : SHIMIZU Takao; KUME Kazuhiko; IZUMI Takashi
     
    Platelet-activating factor (PAF) is a potent phospholipid mediator involved in inflammatory and allergic responses. It is also reported that PAF plays major roles in endotoxin-induced lethality, reproduction and brain development. To determine the role of PAF and its receptor in vivo, we generated a PAF receptor-deficient mice, by honologous recombination. Offspring were obtained with a Menderian distribution. They grow up normally, and no developmental changes are observed in any organs examined. The level of blood immunoglobulins and differential cell counts show no abnormality. When the mice were sensitized and challenged with ovalbumin, the wild type mice showed a marked bronchial constriction, pulmonary edema, hypotension and death. On the other hand, the PAF receptor-deficient mice showed only moderate response to these treatments. Upon challenging with endotoxin, no significant difference was observed in both groups. Thus, we concluded that PAF is deeply involved in anaphylactic responses, while it shows minor role in the endotoxin-induced pathologies and lethality. Considering PAF antagonists show some protective effects on endotoxin-shock, even in PAF receptor knock-out mice, there may exist other targets of PAF receptor antagonists to protect the living system from endotoxin-induced disorders.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1996 -1996 
    Author : 粂 和彦
     
    PAFによる皮膚細胞の増殖制御機構の解析を行い、以下の結果を得た。 PAF受容体を高発現するトランスジェニックマウスには効率に皮膚変化が起こる。それは、表皮肥厚と色素沈着という特徴を持ち、それぞれが表皮ケラチノサイト、真皮メラノサイトの増殖の結果であることが明らかになってきている。その発症経過について、詳細な観察をを行った。生後、2週齢から定時的に、皮膚標本の作製・写真撮影を続けたところ、表皮ケラチノサイトは、2週齢でも既に野生型よりも数が増えており差が認められるが、もう一つの特徴である、メラノサイトの増殖については、2週齢では、まだ差がはっきりせず、3週齢以後に差がつき、外見的には4週齢以後に、相違が顕著となることがわかった。また、トランスジーンとして用いたモルモットPAF受容体cDNAを用いたin situ hybridizationを行った結果、PAF受容体トランスジーンは、生後2週齢以後には表皮ケラチノサイトに高発現細胞していた。特に、表皮が肥厚し、真皮内のメラノサイトの増殖が観察されている部位では、ケラチノサイトにより高い発現が認められた。色素沈着の原因となっているメラノサイトには、トランスジーンの発現がほとんど認められなかった。これらの時間経過と遺伝子発現の解析により、最初に、ケラチノサイトが増殖し、それが引き金となって、メラノサイトの増殖が惹起され、その結果、色素沈着が起こることがわかった。現在、このケラチノサイトとメラノサイトの間の情報伝達について解析を続けている。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1996 -1996 
    Author : 和泉 孝志; 粂 和彦; 清水 孝雄
     
    血小板活性化因子(platelet-activating factor、以下PAF)は生理活性脂質の1つで、種々の病態、アレルギー反応、免疫反応に関与し、多彩な生物活性を持っている。PAF受容体遺伝子はGタンパク質を介する7回膜貫通型の受容体である。本研究では、変異PAF受容体遺伝子を導入した哺乳動物の細胞系を用いて膜貫通部位におけるリガンド結合部位の検索を行った。 膜貫通部位に存在し、ヒト、モルモット、ラット、マウス間で保存されている荷電をもつ23個の極性アミノ酸残基をアラニンに転換したモルモットPAF受容体の変異体を作成し、Cos-7細胞に一過性に発現させてリガンド([^3H]PAF)および拮抗剤([^3H]WEB2086)の結合を調べた。拮抗剤に対する結合には大きな変化はなかったが、第2および第3膜貫通部位の変異体はPAFが結合しやすく第5、第6、第7膜貫通部位の変異体はPAF結合が減少していた。次に大きくPAF結合が変化した変異体をCHO細胞に安定的に発現させ、リガンド結合およびPAFによる細胞内情報伝達を検索した。PAF結合の増加した変異体N100A,T101A,S104AではPAFに対する親和性の増加と、より低濃度での細胞内情報伝達系の活性化が認められ、中でもN100Aは構成的に活性化したPAF受容体であることが判明した。PAF結合の減少した変異体H100A,H248A,Q276AをCHO細胞に安定的に発現させたところリガンド結合および細胞内情報伝達いずれも減少していた。さらにH188,H248,H249の3つのヒスチジン残基はPAFのリン酸残基の結合に関与し、水分子とあわせて亜鉛イオンの結合部位を形成している可能性が示唆された。これらの結果を元にPAF受容体の膜貫通部位の3次元立体モデルを作製し、PAFの結合様式を提唱した。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1996 -1996 
    Author : 和泉 孝志; 粂 和彦; 本田 善一郎; 清水 孝雄
     
    生理活性脂質である血小板活性化因子(PAF)はアレルギー反応、免疫反応などの主要なメディエーターであり、脳、心、肺、腎などにおいて生理学機能を修飾する因子としても作用している。心臓はPAFを産生し代謝する能力を有し、摘出心や心筋細胞をPAFで刺激すると受容体を介して血圧低下や徐脈などの作用が表れるが、PAFの果たす役割や、その情報伝達系の分子的メカニズムはほとんど解明されていない。 ラットの心筋初代培養細胞にPAFを作用させると一過性のカルシウム上昇反応を認め、この反応は受容体拮抗剤により完全に阻害された。また、この細胞系においてPAF刺激はc-fos、c-mycなどの初期応答遺伝子の誘導をもたらした。 PAF受容体を心臓に過剰発現したトランスジェニックマウスでは、PAFの静注によって、血圧低下、徐脈などのため数分以内に死亡した。さらに、このマウスはエンドトキシンに対する感受性も増加していた。野生型マウスでは10匹中1匹が死亡したのみであるが、トランスジェニックマウスでは3分の2が3日以内に死亡した。マウス血小板にはPAF受容体は存在せずトランスジェニックマウスにも存在しないため血栓以外の原因が考えられるが死因はまだ明らかになっていない。 現在、PAF受容体を欠損したマウスを作製し解析を進めているところである。このマウスはPAFの静注に対して血圧低下などの反応を示さず、またその腹腔内白血球はPAFに対するカルシウム上昇の応答性を欠除しており本受容体の欠損が確認された。 今後、さらに初代心筋培養細胞のPAFによるシグナルの解析、PAF受容体高発現トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスの表現型の解析を押し進めていき、心筋細胞におけるPAF受容体の機能を解明する予定である。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1995 -1996 
    Author : SHIMIZU Takao; NAKAMURA Motonao; KUME Kazuhiko; IZUMI Takashi
     
    Endotoxin causes systemic collapse, disseminated intravascular coagulation and lethality, by infection of gram-negative bacteria. Although many reports the production of cytokines, the precise mechanism of pathophysiological events remained obscure. By cell biology and molecular biology techniques, we obtained following results. (1) Elucidation of relation between endotoxin and PAF receptor We established transgenic mice overxpressing PAF receptor. These mice showed severe symptoms of endotoxin shock and death by intravenous administration of small doses of LPS.The lethality was efficiently blocked by the use of PAF receptor antagonists, suggesting that PAF-PAFR is involved in the pathogenesis of endotoxin-induced lethality. (2) Elucidation of LPS action on macrophages By incubating of macrophages with bacterial endotoxin, PAFR mRNA was increased several fold after 4h. MAP kinase was also activated, and the activation related to the tyrosine phosphorylation of Raf-1 kinase.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1995 -1995 
    Author : 粂 和彦
     
    今年度の研究計画に沿った研究の結果、以下の結果を得た。 1.血小板活性化因子(PAF)合成酵素の活性化機構の解析 マウスマクロファージ系細胞株、RAW264.7を用いて、血小板活性化因子合成酵素(アセチル-CoA:リゾ血小板活性化因子アセチル転移酵素)の活性調整機構を検討した。この細胞株では、PAFそのもの、および、LPS(エンドトキシン)で、この酵素が活性化されたが、PAFによる活性化は、投与後1-2分をピークとして、5分後には、基底状態まで戻るのに対して、LPSによる活性化は15分程度をピークとし、その後も持続するようなパターンを示した。また、カルシウムイオノフォア(A23187)もほぼPAFと同様の時間経過で、この酵素活性を活性化すること、および細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する、BAPTAにより、PAFによる活性化が阻害されたことより、PAFは細胞内カルシウム濃度の上昇により、この酵素を活性化していると考えられた。現在この結果は投稿準備中である。 2.PAF合成酵素cDNAクローニング 今年度は、準備段階として、PAF合成酵素活性をもたないホスト細胞の検索を行った。その結果、一過性発現によく使用されるCOS細胞は、強いPAF合成酵素活性をもつことがわかり、スクリーニングには不適であることがわかった。逆にCHO細胞は、ほとんどこの酵素活性を持たず、使用可能なことが示されたので、CHO細胞を用いた一過性発現の最適化を行い、リポフェクション法により、高い発現を得られる条件を見いだした。今後、ライブラリーのスクリーニングを開始する予定である。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1995 -1995 
    Author : 和泉 孝志; 粂 和彦; 清水 孝雄
     
    1.好酸球細胞におけるPAF受容体の発現調節 好酸球はPAFの主要な標的細胞の1つであり、気管支喘息などのアレルギー反応において重要な役割を果たしている。健常人および気管支喘息患者の末梢血好酸球細胞におけるPAF受容体の発現をmRNA量の解析、放射標識化合物を用いた結合実験によって調べたところ、患者好酸球においてはPAF受容体の発現が増加していた。健常人の好酸球はIL-5に反応してPAF受容体の転写および発現が促進されたが、患者好酸球はその能力を欠如していた。このことは、気管支喘息などのアレルギー性疾患における好酸球の活性化にIL-5が関与していることを示すとともに、PAFがアレルギー病態の完成に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。 2.プロモーター領域の機能解析 PAF受容体の5'-非翻訳エクソンは2つありそれぞれ異なったプロモーターが転写を調節している。この領域の機能を調べる目的で、欠失変異を導入したプロモーターにレポータージーン(CAT)を結合したコンストラクトを作製し、ヒト胃癌細胞(JR-St細胞)に導入後、CAT活性を指標にプロモーター機能の解析を行った。さらに、エクソン1に存在するNF-kBのコンセンサス配列に対するTPAやPAFの効果、またエクソン2に存在するERE、TIE、RAREのコンセンサス配列に対するそれぞれの薬物(エストロゲン、TCF-β、レチイノン酸)の効果を解析した。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1995 -1995 
    Author : 和泉 孝志; 粂 和彦; 本田 善一郎; 清水 孝雄
     
    生理活性脂質である血小板活性化因子(PAF)は降圧性の循環動態調節の作用をもっている。心臓はPAFを産生し代謝する能力を有し、摘出心や心筋細胞をPAFで刺激すると受容体を介した作用が表れるが、そのシグナル伝達系の分子的メカニズムはほとんど解明されていない。PAF受容体を過剰発現したトランスジェニックマウスの一系統では、心臓、骨格筋において特に発現量が多く、PAFの静注によって、血圧低下、徐脈などのため数分以内に死亡した。さらに、このマウスはエンドトキシンに対する感受性も増加していた。 ヒト心筋からの遺伝子クローニングにより、心筋には白血球とは異なったプロモーターによって発現制御されているmRNAの存在が明らかになった。心筋型PAF受容体mRNAのプロモーター領域には、AP-2、Sp-1、AP-1、ERE、TRE、TIEが存在した。レポーター遺伝子を用いた解析によって、エストロゲンやレチノイン酸、サイロイドホルモン、TGF-βはそれぞれの応答配列を通じてPAF受容体の発現を実際にコントロールしている可能性が示された。 ラットの心筋初代培養細胞にPAFを作用させると一過性のカルシウム上昇反応を認めることが、アルガス50によるカルシウムイメージングにより示された。また、この細胞系においてPAF刺激はc-mycなどの初期応答遺伝子の誘導をもたらした。 現在、トランスジェニックマウスの表現系の解析をさらにおしすすめ、心筋初代培養細胞におけるPAF受容体を介したシグナル伝達の解明を試みている。さらに、PAF受容体欠損マウスの作製にも成功し表現型の解析を開始した。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1994 -1994 
    Author : 粂 和彦; 和泉 孝志; 清水 孝雄
     
    血小板活性化因子(PAF)は、低濃度で血小板凝集や血圧低下を引き起こす生理活性脂質として同定され、その後、多彩な生理活性が調べられている。またある種の細胞では増殖因子として働く可能性が示唆されてきた。そこで、癌化のモデル細胞系として、ラットの正常線維芽細胞であるNRF細胞を用いてPAFの増殖と癌化への関与を調べ、以下の結果を得た。 1.われわれのクローン化したPAF受容体を発現ベクターに組み込み、NRK細胞に導入して、高発現する細胞を樹立した。野生株細胞でのPAF受容体の発現量は検出限界以下だった。 2.これらの細胞を血清除去により静止期に停止させた後、PAFを添加して増殖に対する影響を^3H-チミジンの取り込みで調べたところ、低濃度では増殖を亢進する作用を認めたが、逆に高濃度では増殖を阻害した。 3.そこで、PAF分解酵素に耐性のPAFの誘導体であるC-PAFを用いたところ、低濃度でも増殖を阻害することがわかった。 4.この増殖抑制作用は強力でnMのオーダーで効果が認められ、v-mos,v-K-ras,v-srcなどの癌遺伝子による癌化も強く抑制した。 これらの結果は、当初の予想に反して、PAFがなんらかの機構で増殖や癌化の抑制に働く可能性を示唆した。生理的意義はまだ不明だが、このPAFによる抑制系は、チロシンキナーゼからの増殖シグナルの解析にも大変有用と考えられた。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1994 -1994 
    Author : 和泉 孝志; 粂 和彦; 本田 善一郎; 清水 孝雄
     
    PAF受容体遺伝子は2種類の異なったプロモーターによって転写調節を受けており、2つの異なったタイプ(すなわち白血球タイプと心筋タイプ)の2種類のmRNAを産生する。このうち心筋タイプのmRNAのプロモーター領域にはERE(estrogen resposible element)、TIE(TGF-βinhibitory element)、RARE(retinoic acid responsuble element)が存在することがわかっている。このプロモタ-の機能を調べる目的で、CAT遺伝子を結合したコントラクトを作製し解析を行った。その結果、エストロゲンによる転写活性の促進、ならびにTGF-βによる抑制を認めた。 現在までPAF受容体を過剰発現したトランスジェニックマウスの作製に成功しており、そのうちの一系統では、心臓、骨格筋において特に発現量が多かった。現在このトランスジェニックマウスの表現型の解析を行っているところである。このマウスにおいては体重が対称群に比べて約20%低下しており、雌からはトランスジーンが子孫に伝わりにくいなどの特徴が認められた。通常マウスではほとんど変化の見られない量のPAFを静注すると、高発現系統マウスにおいては収縮期血圧の低下、徐脈、房室ブロック、QT時間の延長がみられ、数分以内に死亡した。さらに、PAFに対する異常な気道内圧の上昇が認められた。現在、このトランスジェニックマウスの子孫を増やしているところである。 今後、心筋初代培養細胞系を確立して、心筋細胞におけるPAF刺激による細胞内情報伝達機構(イノシトールリン脂質回転、アラキドン酸遊離、cAMP産生抑制、MAPキナーゼ活性化など)の測定を行う予定である。さらに、心筋細胞におけるPAF刺激を介する細胞内情報伝達機構およびプロトオンコジーンの動きを調べ、PAF刺激が心筋肥大や形質変化に与える影響を検討する。
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1994 -1994 
    Author : 本田 善一郎; 粂 和彦; 清水 孝雄
     
    本研究の目的は、三量体G蛋白質の下流にプログラムされた神経細胞死のメカニズムを解明することにある。我々はPC12モデル神経細胞に活性型Gqを発現させる実験から、Gq経路の活性化が神経突起の成長(細胞分化)--神経細胞死を誘導することを見い出した。本年度はまず、1)Gq、Gq連関受容体の下流のシグナルの分析、2)Gq発現によってもたらされる細胞生存に不利な機能素子修飾の検索、を行った。 1)線維芽細胞においては活性型Gq、Gq連関型受容体は分化の上位因子であるMAP kinase,MAP kinase kinaseを強く活性化した(Honda,et al.(1994)J.Biol.Chem.269,2307-15,Watanabe,Waga,Honda,et al.J.Biol.Chem.in press)が、活性型Gqを誘導的に発現したPC12細胞ではフォスフォリパーゼC活性化はみられるもののMAP kinase活性は変化していない(未発表)。現在他の機能素子修飾を探索中である。 2)モデル細胞として頻用されるXenopus oocyte遺伝子発現システムを用い、Gq経路がIP3受容体のdown regulationを通して種々の受容体からのカルシウムシグナルを完全に遮断することを見い出した(Honda,et al.J.Biol.Chem.in press)。各種増殖因子受容体の発する増殖シグナルには細胞内カルシウムが重要な役割を果たすことがよく知られている。Gq--IP3受容体消失というメカニズムは上記の三量体G蛋白質の下流にプログラムされた細胞生存に不利な機能素子修飾の一部を説明する可能性が高い。
  • Japan Society for the Promotion of Science：Grants-in-Aid for Scientific Research
    Date (from‐to) : 1993 -1994 
    Author : SHIMIZU Takao; HONDA Zenichiro; KUME Kazuhiko; IZUMI Takashi
     
    Following results were obtained on the physiological role and cellular signaling of platelet-activating factor (PAF). (1)Cellular signaling via PAF receptor By using transfected receptor in CHO cells, cellular signaling after PAF application was determined. PAF stimulates phosphoinositide turnover, mitogen-activated protein (MAP) kinase, phospholipase A2, and inhibits adenylate cyclase. From the results of PTX-treatment, PAF receptor appears to couple with two types of G-proteins. Ca-independent activation of MAP kinase was inhibited by wortmannin, suggesting a wortmannin-sensitive molecule such as phosphatidylinositol 3-kinase is present between Gi and MAP kinase. To determine the molecular mechanisms of signal desensitization by PAF,we prepared CHO cells carrying wild-type, C-terminal deletion mutant, and substitution mutant (Ser, Thr to Ala) receptors. We found that C-terminal cytoplasmic tail is not required for forward signal transduction, but it is essential for signal-shut down. A family of GRK (G-protein receptor kinase) may be involved in the phosphorylation of Ser/Thr residues leading to signal shut down. (2)Genomic structure of PAF receptor. Human PAF receptor gene is present as a single copy in haploid on the chromosome 1q. The gene consists of three exons, separated each other > 20kb intron. Two5'-noncoding exons has distinct transcriptional start site, and promoters. These exons are alternatively spliced to a common splice acceptor to yield two different mRNAs. Transcript 1 is present in almost all tissues, and up-regulated by PAF or endotoxin through its NF-kB site. Transcript 2 is expressed in more tissue-specific way, and up-regulated by estrogen, and down-regulated by TGF-b. The physiological and pathological significance of these promoters are currently under investigation.
  • 日本学術振興会：科学研究費助成事業
    Date (from‐to) : 1993 -1993 
    Author : 粂 和彦
     
    今年度は、研究計画に沿って実験を行い、以下の結果を得た。 1.酵母のGalphaタンパク質(GPA1)欠損株(名古屋大学理学部・松本邦弘教授より供与)にラットGsalphaタンパク質と、モルモットGi2alphaタンパク質を、酵母発現ベクターに組み込み、導入したところ、Gsalphaでは機能相補が認められたが、Gi2alphaでは、相補できなかった.発現量を、増やすために、5'非翻訳領域をほぼ完全に取り除き、多コピー型で強力なプロモーターを持つベクターを使用しても、やはり、機能相補は認められなかった. 2.そこでGi2alpha蛋白質を酵母内で機能させるために、三量体G蛋白質の他のサブユニットを哺乳動物由来のものに置き換えることを目的として、酵母Gbeta(STE4)欠損株にウシGbetaを、酵母Ggamma(STE18)欠損株に、ウシGgammaを、それぞれ導入したが、機能相補は認められなかった. 3.上述の酵母GPA1をラットGsalphaに置き換えたものに、beta-アドレナリン受容体を導入したところ、この受容体のアゴニストであるイソプロテレノールの添加に反応して、酵母の接合ホルモン受容体からのシグナル伝達系が活性化された.このことは、酵母の形態変化と、接合ホルモン誘導性遺伝子(FUS1)の転写誘導により確認された. 以上の結果、現段階でこの発現系は、Gsalpha共役受容体のクローニングには使用可能だが、目的とするGialpha共役受容体のクローニングには使用できず、さらに改変が必要と考えられ、現在、さらに改変を進行中で、今年度は本研究内容の公表には至らなかった.

Other link

researchmap


Copyright © MEDIA FUSION Co.,Ltd. All rights reserved.